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【科研專題】自噬研究全解析(二)想研究自噬流?這幾種檢測(cè)方法你得知道!

2025-04-28 13:50:16

來源/作者:普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)

    大家好!今天普拉特澤生物繼續(xù)跟大家一起學(xué)習(xí)【科研專題】自噬研究全解析(二)。想研究自噬流?這幾種檢測(cè)方法你得知道!

自噬,這一細(xì)胞內(nèi)高度保守的降解過程,就像細(xì)胞專屬的 “清潔隊(duì)”,能清除受損的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),在發(fā)育、免疫和疾病發(fā)生發(fā)展等多個(gè)生理、病理過程中扮演關(guān)鍵角色。自噬流,描述的正是自噬發(fā)生過程中,自噬體形成、與溶酶體融合,以及底物降解的這一動(dòng)態(tài)流程。檢測(cè)自噬流,對(duì)理解自噬機(jī)制、疾病發(fā)生發(fā)展及尋找干預(yù)靶點(diǎn)至關(guān)重要。


檢測(cè)自噬流的方法有多種,以下是一些常見的方法:


電鏡觀察自噬體的形成——自噬檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)

自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),需要使用透射電子顯微鏡觀察自噬體的形態(tài)。


電鏡檢測(cè)自噬主要是基于辨認(rèn)自噬體結(jié)構(gòu)特征


Western blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白

LC3貫穿整個(gè)自噬過程,是目前公認(rèn)的自噬標(biāo)記物。利用WB檢測(cè)LC3- 11/I比值的變化以評(píng)估自噬的強(qiáng)弱。LC3-I/II 的形成和降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,瞬時(shí)LC3-I I表達(dá)不能反映自噬程度,需增加自噬的抑制劑、自噬的激動(dòng)劑,正反證明自噬的發(fā)生。


p62作為自噬的重要受體,主要依賴于自噬途徑進(jìn)行降解。因此,P62的蛋白水平也常常用來指示自噬的降解情況。


LC3 雙熒光標(biāo)記法:觀測(cè)自噬流的神器

mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系讓自噬研究更上一層樓!自噬流的順暢對(duì)細(xì)胞生理功能至關(guān)重要哦!


這個(gè)方法是用同時(shí)帶有 RFP 和 GFP 的病毒感染細(xì)胞。GFP 在酸性環(huán)境下會(huì)淬滅,而 mRFP 不受影響。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí),會(huì)看到明亮的黃色熒光,這就是被紅色熒光和綠色熒光同時(shí)標(biāo)記的自噬體啦!當(dāng)自噬體和溶酶體融合,pH 值降低,GFP 熒光淬滅,就只能看到紅色熒光了呢!所以,GFP 的減弱表示自噬溶酶體形成順利,GFP 越少,自噬小體到自噬溶酶體的流通就越順暢。反之,融合被抑制,自噬溶酶體進(jìn)程就受阻了哦!而 mRFP 一直穩(wěn)定表達(dá),通過 GFP 與 mRFP 的熒光比例就能評(píng)價(jià)自噬。


在研究自噬過程中,構(gòu)建自噬雙標(biāo)穩(wěn)株(如mRFP-GFP-LC3系統(tǒng))需要配套的質(zhì)粒、病毒和抗體工具。以下是普拉特澤生物針對(duì)自噬雙標(biāo)研究的全面推薦,涵蓋質(zhì)粒、病毒和抗體,幫助您高效開展實(shí)驗(yàn)。
常用的病毒工具推薦

(1)慢病毒(Lentivirus)


特點(diǎn):高效感染多種細(xì)胞類型,可穩(wěn)定整合到基因組中,適合構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系。


推薦病毒:

Lv-LC3B-oe(mCherry,GFP)慢病毒

Lv-LC3-oe(RFP,GFP)慢病毒


以上兩種均可用于構(gòu)建自噬雙標(biāo)穩(wěn)株、監(jiān)測(cè)自噬體形成。


(2)腺病毒(Adenovirus


特點(diǎn):高感染效率,適合短期表達(dá)實(shí)驗(yàn)。


推薦病毒:

Adv-LC3B-oe(mCherry,GFP)腺病毒

Adv-LC3B-oe(RFP,GFP)腺病毒


(1)A549-mRFP-GFP-LC3B自噬雙標(biāo)穩(wěn)株

(2)MCF-7-mCherry-GFP-LC3自噬雙標(biāo)穩(wěn)株     

(3)SH-SY5Y-mCherry-GFP-LC3自噬雙標(biāo)穩(wěn)株

以下是我們構(gòu)建自噬雙標(biāo)穩(wěn)株的案例分享:

質(zhì)粒產(chǎn)品推薦


質(zhì)粒是構(gòu)建自噬雙標(biāo)穩(wěn)株的基礎(chǔ)工具,以下是常用的自噬相關(guān)質(zhì)粒:
(1)mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒
用途:用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)自噬流(autophagic flux)。GFP在酸性環(huán)境中淬滅,而mRFP穩(wěn)定,因此可以區(qū)分自噬體(GFP+/mRFP+)和自噬溶酶體(mRFP+)。


推薦

ptfLC3(貨號(hào):BR124)

pCDH-CMV-mRFP-GFP-hLC3B-EF1A-Puro(豐暉貨號(hào):BR641)


(2)LC3相關(guān)質(zhì)粒
用途:LC3是自噬的標(biāo)志性蛋白,可用于研究自噬體的形成。

推薦:

pEGFP-LC3b(貨號(hào):BR161)

pmCherry-LC3a(貨號(hào):BR156)


(3)自噬相關(guān)基因過表達(dá)質(zhì)粒
用途:研究特定基因?qū)ψ允傻恼{(diào)控作用。

推薦:

pCMV-ATG5(貨號(hào):22952)     

pCMV-Beclin1(貨號(hào):24388)

pCMV-ULK1(貨號(hào):27631)


(4)自噬相關(guān)基因敲除質(zhì)粒
用途:通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除自噬相關(guān)基因。

推薦:

lentiCRISPR v2(貨號(hào):BR521)

pSpCas9(BB)-2A-GFP(貨號(hào):BR080)


抗體產(chǎn)品推薦
抗體是驗(yàn)證自噬相關(guān)蛋白表達(dá)和功能的重要工具。以下是常用的自噬相關(guān)抗體:
(1)LC3抗體
用途:檢測(cè)LC3-I和LC3-II的轉(zhuǎn)化,評(píng)估自噬活性。

推薦抗體:

LC3B Polyclonal Antibody(貨號(hào):Fab8383)


(2)p62/SQSTM1抗體
用途:檢測(cè)自噬底物的降解,評(píng)估自噬流。

推薦抗體:

SQSTM1/p62 rabbit pAb(貨號(hào):Fab14039)


(3)ATG5抗體
用途:檢測(cè)ATG5蛋白表達(dá),研究自噬體的形成。

推薦抗體:

ATG5 Rabbit Polyclonal Antibody(貨號(hào):Fab1156)


(5)ULK1抗體
用途:檢測(cè)ULK1蛋白表達(dá),研究自噬的起始。

推薦抗體:

ULK1 Polyclonal Antibody(貨號(hào):Fab15637)

關(guān)于以上相關(guān)產(chǎn)品都可以在普拉特澤生物官網(wǎng):http://www.jx3dscan.com/

看完這些 “細(xì)胞清潔工” 的檢測(cè)門道,你是否好奇:

自噬流紊亂究竟如何推動(dòng)疾病進(jìn)程?或是哪種方法最適合你的研究?

歡迎在評(píng)論區(qū)分享你的腦洞或疑問,說不定下一篇深度解析,就為你量身定制!

別忘了點(diǎn)贊收藏,把這份 “自噬流研究指南” 分享給實(shí)驗(yàn)室伙伴~ 

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