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02.RNA分離
在細(xì)胞裂解后，加入氯仿進(jìn)行離心。氯仿的密度大于水，且能與苯酚結(jié)合，從而抽提酸性的苯酚。苯酚的存在促使RNA進(jìn)入水相，而大部分DNA和蛋白質(zhì)則保留在中間相或下層有機(jī)相中。通過(guò)離心，可以實(shí)現(xiàn)RNA與其他細(xì)胞成分的分離。

①異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一種強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，從而使核蛋白與核酸解聚，將RNA釋放到溶液中。同時(shí)，它還能有效抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶活性，保護(hù)RNA的完整性。
②苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖然可以變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此常與其他成分聯(lián)合使用以增強(qiáng)效果。
③8-羥基喹啉可以抑制RNase活性，與氯仿聯(lián)合使用時(shí)可顯著增強(qiáng)對(duì)內(nèi)源性和外源性RNase的抑制作用。
④β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵，從而進(jìn)一步抑制RNase活性。

1. 12孔板每孔加入700 μL的Trizol試劑（6孔板每孔加入1 mL，組織切取50 mg左右，加入1 mL的Trizol）后，于室溫裂解10 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

2. 用槍吹打細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移至新的EP管中，每管加入140 μL的三氯甲烷（即加入Trizol體積1/5的三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min）。

3. 12000 rpm，4 ℃，離心20 min，樣品會(huì)分成3層：紅色的有機(jī)相、中間層和上層無(wú)色的水相，RNA主要在水相中。

4. 小心轉(zhuǎn)移上層水相（300 μL）至新的EP管中，這個(gè)過(guò)程操作要格外小心，不要吸取到有機(jī)相，可以使用黃槍頭套著小槍頭進(jìn)行吸取，分2次吸取。加入等量體積300 μL的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min，使RNA沉淀。

5. 12000 rpm，4 ℃，離心15 min，棄上清。

6. 加入1 mL 75%乙醇，8000 rpm，4 ℃，離心5 min，重復(fù)2次洗滌能夠提高RNA的純度。

7. 離心結(jié)束后，使用吸引器將乙醇吸取干凈；無(wú)吸引器的話可以將上清倒掉后，再離心1～2 min，使用黃槍頭套白槍頭的方法將上清棄去。

8. 室溫放置晾干RNA沉淀，一般2～5 min即可，具體時(shí)間看RNA沉淀的大小，切勿干燥過(guò)度，會(huì)降低RNA的溶解度。

9. 加入適量DEPC水（無(wú)RNase水）用槍頭吸打幾次使RNA充分溶解。

[小編提醒] rpm在論文寫作時(shí)應(yīng)換算為“×g”的形式。