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利用熒光標記的二級抗體（即二抗）與目標抗原結(jié)合，從而實現(xiàn)對特定蛋白質(zhì)的檢測。普拉特澤生物承接等病理染色相關(guān)服務(wù)上萬例，積累了操作大量經(jīng)驗，為大家詳細分享免疫熒光實驗方法，同時為廣大科研工作者開展線上的理論培訓與線下實操，可承接免疫熒光實驗外包服務(wù)

一、免疫熒光二抗法VS TSA法

二抗法

熒光二抗法是利用熒光標記的二級抗體(即二抗)與目標抗原結(jié)合，從而實現(xiàn)對特定蛋白質(zhì)的檢測。操作相對簡單，適用于多種樣本和抗體，缺點是信號強度可能受一抗和二抗結(jié)合效率的影響，對低豐度抗原信號較弱。

TSA法

TSA法是一種信號放大技術(shù)，其主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(即熒光標記的酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點)，產(chǎn)生大量的酶促反應(yīng)，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸、酪氨酸殘基)結(jié)合，在抗原-抗體結(jié)合部位形成大量的熒光素沉積，實現(xiàn)信號放大。還可以通過多次重復免疫標記，使用不同的熒光酪胺實現(xiàn)多重熒光染色。同時也適用于相同來源一抗的雙重熒光免疫標記。

二、TSA實驗流程
1、石蠟切片脫蠟至水:依次將石蠟切片放入環(huán)保型脫蠟液l10min-環(huán)保型脫蠟液I10min-環(huán)保型脫蠟液I 10min-無水乙醇15min-無水乙醇115min-無水乙醇I 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復:組織切片置于盛滿抗原修復緩沖液的抗原修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復。維持緩沖液沸騰10min左右，此過程中防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(這里是以微波加熱法抗原修復方式為例，具體修復方式需根據(jù)組織類型及抗體種類選擇對應(yīng)的抗原修復液及修復方式)

3、雙氧水封閉:切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈(防止試劑流走)，切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右，封閉內(nèi)源性過氧化物酶。將玻片置于PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、血清封閉:切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5、加一抗:輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于透明濕盒內(nèi)4°C孵育過夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))。
6、加對應(yīng)種屬HRP標記二抗:將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。
7.加iF488-TSA工作液:將玻片置于PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加配制好的iF488-TSA工作液，避光室溫孵育10 min。孵育完后玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5 min

8.抗體洗脫

8.1微波處理:組織切片置于盛滿抗原修復液(根據(jù)組織類型及抗體選擇合適的抗原修復液)的修復盒中進行微波加熱處理，去除已經(jīng)結(jié)合的一抗二抗。(加熱的溫度和時間建議:加熱到95℃以上，維持15分鐘。)此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。
8.2洗脫處理:切片稍甩干后將恢復至室溫的抗體洗脫液鋪滿整個組織，室溫孵育5 min后去除抗體洗脫液，再次滴加足量的抗體洗脫液完全覆蓋組織，37°C孵育30 min，孵育完成后將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。
9.血清封閉:切片稍微甩干后，向組織上滴加3%BSA或血清室溫封閉30 min，具體根據(jù)第二種一抗及對應(yīng)的二抗種屬決定封閉試劑。

10.加第二種一抗:在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。(濕盒底部加少量水防止抗體蒸發(fā))。

11.加對應(yīng)的HRP標記的二抗:玻片置于PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min.

12.加iF555-TSA:玻片置于PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加配制好的iF555-TSA工作液，避光室溫孵育10 min。孵育完后，玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。
13.DAPI復染細胞核:切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。14.自發(fā)熒光淬滅:玻片置于PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈內(nèi)加入組織自發(fā)熒光淬滅劑避光孵育5 min，流水沖洗10 min。15.封片:切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

16.鏡檢拍照:切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，也可用熒光掃描儀掃描成像。切片置于避光切片盒內(nèi)4℃可保存15天。

三、TSA法實驗注意事項

1.與二抗相比，TSA 試劑具有更高的靈敏度和更強的信號放大效果。因此一抗使用濃度需降低，一般在抗體說明書建議的稀釋比基礎(chǔ)上再擴大5-10倍，以減少非特異性結(jié)合導致的背景熒光。建議設(shè)置一抗梯度濃度獲得最佳效果。

2.如背景熒光較強，建議增加組織自發(fā)熒光淬滅步驟。

3.熒光Tyramide的建議稀釋比是1:500,0檢驗結(jié)果調(diào)整稀釋比例(調(diào)整范圍1:1000)。

4.為保證抗體洗脫效果及熒光多重標記效果，正式多重標記之前需分別做各個抗體的TSA單標測試(即一抗-HRP二抗一對應(yīng)多中的TSA)，確定每個抗體單標都能做出較理想的陽性后再根據(jù)單標測試結(jié)果去確定多標的抗原修復條件，抗體順序等實驗條件
5.如果有些抗體效價高，親和力較強，不洗脫徹底，可提高洗滌溫度至50℃ 30 min或增加洗脫次數(shù)，即組織上加入抗體洗脫液37℃孵育 30 min后，去掉抗體洗脫液，再入新的抗體洗脫液，繼續(xù) 37℃孵育 30 min6.抗體洗脫液流動性強，片子未水平放置時，試劑易流出圈外，影響洗脫效果，需在操作過程注意切片平放。

6..操時需帶手套，口罩，穿實驗服，避免話劑接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸到敏感區(qū)域，立即用大量清水沖洗。

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