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2. 轉(zhuǎn)染適配性：常規(guī)細(xì)胞可選脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞建議采用電轉(zhuǎn)或慢病毒遞送系統(tǒng)；

3. 基因表達(dá)驗(yàn)證：通過 qPCR 提前確認(rèn)目標(biāo)基因在所選細(xì)胞系中表達(dá)，否則無(wú)法通過后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證敲除效果。
   

   
   

                                        新手貼士：若時(shí)間緊張，可直接選用 8000 + 現(xiàn)貨 KO 細(xì)胞庫(kù)資源，涵蓋常見研究基因，即拿即用無(wú)需自行構(gòu)建。

• 解凍操作：37℃水浴鍋中快速晃動(dòng)凍存管，待冰晶剩余 1/3 時(shí)立即取出，避免溫度過高導(dǎo)致細(xì)胞損傷；

• 離心保護(hù)：1000rpm 離心 5 分鐘后，用含 10% FBS 的完全培養(yǎng)基重懸，切忌直接吹打細(xì)胞團(tuán)；

• 密度把控：復(fù)蘇初期細(xì)胞密度維持在 5×10? cells/mL，貼壁細(xì)胞需靜置 6-8 小時(shí)再更換培養(yǎng)基。

• 培養(yǎng)基定制：CHO-K1 等工程細(xì)胞系可在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加 2mg/L 重組胰島素，細(xì)胞增殖效率提升 17%，蛋白產(chǎn)量提高 51%；

• 氣體平衡：CO?濃度嚴(yán)格控制在 5%，濕度保持 95% 以上，避免培養(yǎng)基 pH 波動(dòng)超過 0.2；

• 傳代時(shí)機(jī)：貼壁細(xì)胞融合度達(dá) 70%-80% 時(shí)傳代，懸浮細(xì)胞密度至 2×10? cells/mL 時(shí)稀釋，過度密集易導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

• 極限稀釋法：將細(xì)胞稀釋至 0.5 個(gè) / 孔，添加 20% 條件培養(yǎng)基（同系細(xì)胞上清），克隆形成率提升 30%；

• FACS 分選法：對(duì)帶熒光標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分選，適用于難篩選的懸浮細(xì)胞，分選后需靜置 24 小時(shí)再觀察；

• 克隆鑒定：至少擴(kuò)增 50-100 個(gè)單克隆，通過 PCR + 測(cè)序確認(rèn)雙等位基因敲除，避免雜合克隆干擾實(shí)驗(yàn)。

• 問題根源：sgRNA 設(shè)計(jì)不合理或轉(zhuǎn)染方式錯(cuò)配；

• 解決策略：

• 用 CRISPick、CHOPCHOP 工具設(shè)計(jì) GC 含量 40%-60% 的 sgRNA，優(yōu)先選擇早期外顯子靶點(diǎn)；

• 難轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用 Cas9 RNP（蛋白 + sgRNA 復(fù)合物）瞬時(shí)遞送，降低脫靶同時(shí)提升效率。

• 問題根源：雙等位基因編輯概率低（通常 < 10%），或目標(biāo)基因?yàn)楸匦杌颍?/span>

• 解決策略：

• 同時(shí)設(shè)計(jì) 3 個(gè)不同 sgRNA 靶點(diǎn)，編輯效率可提升至 40% 以上；

• 必需基因改用條件性 KO 或 CRISPRi（基因沉默）方案，避免細(xì)胞死亡。

• 問題根源：培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不足或存在支原體污染；

• 解決策略：

• fed-batch 培養(yǎng)模式中，每 48 小時(shí)添加含 8mg/L 重組胰島素的補(bǔ)料培養(yǎng)基，蛋白產(chǎn)量提高 49%；

• 每周用 PCR 檢測(cè)支原體，污染細(xì)胞用 0.1% 慶大霉素處理 24 小時(shí)。

• 問題根源：Cas9 持續(xù)表達(dá)或 sgRNA 同源性過高；

• 解決策略：

• 選用高保真 Cas9 蛋白，減少非特異性切割；

• 驗(yàn)證階段結(jié)合 Sanger 測(cè)序（基因組層面）+Western Blot（蛋白層面）雙重確認(rèn)。

• 問題根源：凍存液配方不當(dāng)或降溫速度失控；

• 解決策略：

• 采用 10% DMSO+90% FBS 凍存液，貼壁細(xì)胞可額外添加 5% 海藻糖；

• 程序降溫盒中 - 80℃靜置 12 小時(shí)后轉(zhuǎn)移至液氮，避免直接冷凍。
  

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1. 基因組層面：PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因片段，Sanger 測(cè)序確認(rèn)移碼突變或片段缺失；

2. 蛋白層面：Western Blot 檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)，無(wú)條帶或條帶顯著減弱即為有效敲除；

3. 功能層面：通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光或細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表型變化，例如腫瘤相關(guān)基因 KO 后需檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1. 設(shè)計(jì)工具：源井生物 EZ-editor?系統(tǒng)（1 分鐘生成 3 套敲除方案）、CRISPOR（脫靶預(yù)測(cè)）；

2. 培養(yǎng)試劑：無(wú)血清化學(xué)成分限定培養(yǎng)基（適合 CHO-K1 細(xì)胞）、重組胰島素補(bǔ)料（提升產(chǎn)能）；

3. 驗(yàn)證試劑盒：T7E1 核酸酶檢測(cè)試劑盒（快速評(píng)估編輯效率）、WB 內(nèi)參抗體（確保實(shí)驗(yàn)可靠性）。
   
   

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