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  相信很多浸泡在實(shí)驗(yàn)室的科研打工人都遇到過類似的問題：

轉(zhuǎn)一個(gè)質(zhì)?；?qū)?xì)胞加藥處理后，同一個(gè)基因的mRNA水平和蛋白水平出現(xiàn)了截然不同的趨勢：

有的mRNA水平變高了，蛋白水平卻變低；

有的mRNA水平變低，蛋白水平又變高了。

所以就陷入了無限循環(huán)的篩靶驗(yàn)證或重復(fù)實(shí)驗(yàn)中

。。。

但其實(shí)這是一種相對常見的現(xiàn)象，

真核生物的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾非常復(fù)雜，而我們的認(rèn)知不足以了解微觀世界的一切。

背景知識(shí)

m6A(N6-methyladenosine，N6-甲基腺嘌呤）是常見的一種轉(zhuǎn)錄后修飾，介導(dǎo)了超過80%的RNA甲基化。

然而細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境復(fù)雜，不同mRNA的m6A修飾、不同細(xì)胞環(huán)境下的m6A修飾，都發(fā)揮了不同的生物學(xué)功能，需要大家深入探索并摸索規(guī)律，因此它也是表觀遺傳學(xué)的熱點(diǎn)！hot！

今天小編要給大家分享的是2019年發(fā)表于《Nature Communications》（IF：13）上的一篇文章，作者使用大量的分子互作技術(shù)（RIP、CoIP、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)等）探討肝癌細(xì)胞中m6A是如何調(diào)節(jié)癌細(xì)胞EMT的。

為了便于大家理解，小編嘔心瀝血做了一個(gè)本文的思路導(dǎo)圖：

作者揭示，在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要步驟—上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中，m6A修飾的mRNA在癌細(xì)胞中增加。m6A的Writer基因METTL3的抑制下調(diào)了肝癌細(xì)胞中m6A的修飾豐度。作者還發(fā)現(xiàn)，Snail是EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，Snail CDS區(qū)中的m6A而不是3’UTR區(qū)的m6A觸發(fā)了肝癌細(xì)胞中Snail mRNA的多核糖體介導(dǎo)的翻譯。這項(xiàng)研究突出了m6A在調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞EMT中的關(guān)鍵作用。

結(jié)果解析（重點(diǎn)已經(jīng)給大家加粗高亮顯示了哦）

Fig1. 癌細(xì)胞的EMT（上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）受mRNA的m6A水平調(diào)節(jié)

作者使用TGF-β誘導(dǎo)Hela/HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT（補(bǔ)充圖片里面證明了TGF-β誘導(dǎo)后發(fā)生EMT進(jìn)程），之后使用LC-MS/MS的方法對其進(jìn)行m6A的檢測，發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)組的m6A水平顯著高于對照組（a），由此說明癌細(xì)胞EMT的發(fā)生伴隨mRNA的m6A水平增高。甲基化轉(zhuǎn)移酶（writers）在m6A的發(fā)生中是必不可缺的，作者之后對Hela細(xì)胞的METTL3（writers的一種）進(jìn)行敲除（Mettl3Mut/? HeLa）。

Mettl3Mut/? HeLa的遷移能力以及侵襲能力顯著低于Mettl3Mut HeLa（b-劃痕實(shí)驗(yàn)，c-Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)）。Mettl3Mut/? HeLa組的MMP2和FN（間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物）的mRNA和蛋白水平顯著低于Mettl3WT HeLa，而E-cad（與侵襲轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)）的mRNA和蛋白水平顯著高于Mettl3WT HeLa（d，e，g），說明METTL3的敲除可抑制癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

為了驗(yàn)證m6A水平在EMT中的作用，作者進(jìn)行了ALKBH5（關(guān)鍵的m6A去甲基酶）過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ALKBH5過表達(dá)處理與METTL3敲除處理結(jié)果一致（MMP2、FN下調(diào)，E-cad上調(diào)）（f）。TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示肝癌組織中的METTL3顯著高于正常組織（h），且肝癌組織中 CDH1（E-cad的基因名）的表達(dá)與METTL3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（i）。

Fig2. 在經(jīng)歷EMT的細(xì)胞中m6A調(diào)節(jié)的基因的變化

確認(rèn)m6A在EMT中存在調(diào)控功能，那具體是哪個(gè)基因起到中間作用了呢？作者對EMT 前后細(xì)胞進(jìn)行m6A-seq。在對照和EMT細(xì)胞中，GGAC基序都高度富集在m6A位點(diǎn)內(nèi)（a）。起始和終止密碼子附近的m6A峰特別豐富，且主要集中在外顯子區(qū)域（b，c）。作者將對照與EMT細(xì)胞進(jìn)行比較，鑒定出128個(gè)發(fā)生了1.5倍的m6A變化的基因。GO分析表明少數(shù)基因與經(jīng)歷EMT的癌細(xì)胞中粘附連接和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的形成有關(guān)（d）。 綜上，m6A修飾發(fā)生在少數(shù)與EMT期間的細(xì)胞連接，粘附和遷移有關(guān)的基因上。

Fig3. 在癌細(xì)胞中，Snail參與m6A調(diào)控EMT進(jìn)程

為了找到涉及癌細(xì)胞的m6A調(diào)控EMT的潛在靶點(diǎn)，作者鑒定了84個(gè)具有關(guān)鍵功能的EMT相關(guān)基因與61個(gè)m6A調(diào)控基因（大于2.0倍m6A變化）之間進(jìn)行Overlap分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因在EMT前后 m6A 和表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化（a，b）。其中Snail是一個(gè)已知調(diào)控EMT 的轉(zhuǎn)錄因子，因此作者接下來將研究的重點(diǎn)放在 Snail 上。作者進(jìn)行m6A RIP- qPCR，EMT組的SNAI1 mRNA的m6A水平顯著高于對照組（2.3倍）（c）。與control組相比，METTL3敲除組以及ALKBH5過表達(dá)組的Snail表達(dá)水平顯著降低（d）。由此確認(rèn)Snail同時(shí)受到METTL3（m6A甲基轉(zhuǎn)移酶）和ALKBH5（m6A甲基位點(diǎn)識(shí)別蛋白）的調(diào)控，即Snail的表達(dá)水平受m6A 的修飾水平調(diào)控。隨后，作者對Snail在EMT中的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，顯示Snail 可以促進(jìn) EMT 的發(fā)生，且Snail 過表達(dá)可回補(bǔ)METTL3缺失引起的EMT進(jìn)程減緩（e，f）。

Fig4. 在癌細(xì)胞中，m6A觸發(fā)Snail mRNA的翻譯

前面已經(jīng)證明Snail受m6A修飾調(diào)控，那調(diào)控具體發(fā)生在什么水平呢？qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn) METTL3敲除之后，pre-mRNA和mature mRNA的表達(dá)水平顯著升高（這一點(diǎn)結(jié)果與圖3d的蛋白表達(dá)水平結(jié)果相反），且兩者的穩(wěn)定性也顯著升高（a，c，d）；但是Mettl3Mut /-細(xì)胞中Snail蛋白水平下調(diào)，Snail蛋白的穩(wěn)定性在野生型和Mettl3Mut /-HeLa細(xì)胞之間無顯著差異（e），這表明m6A使得Snail mRNA穩(wěn)定性降低而不影響其蛋白穩(wěn)定性。在CHX（蛋白質(zhì)翻譯抑制劑）而非MG-132（蛋白酶體活性抑制劑）的存在下，Mettl3Mut /-HeLa細(xì)胞中TGF-β誘導(dǎo)的Snail表達(dá)減弱（f）。之后作者構(gòu)建了pmirGLO-Snail熒光素酶報(bào)告載體，結(jié)果顯示Snail在Mettl3Mut /-HeLa細(xì)胞中的翻譯效率明顯低于HeLa WT細(xì)胞中的翻譯效率（g）。綜上表明m6A誘導(dǎo)的Snail表達(dá)與翻譯調(diào)控有關(guān)。

核糖體分析結(jié)果顯示，與HeLa WT細(xì)胞相比Mettl3Mut /-細(xì)胞中80S單核糖體和多核糖體（>80S）的減少（h，i）。qPCR顯示Mettl3Mut /-細(xì)胞翻譯活性多核糖體（> 80S）中的Snail mRNA顯著低于野生型細(xì)胞（j）。提示Snail mRNA的翻譯水平在EMT過程中得到了改善。

Fig5. m6A-甲基化的CDS調(diào)節(jié)Snail的翻譯

m6A-RIP seq數(shù)據(jù)顯示，在Snail CDS中鑒定出1個(gè)GGAC基序，在3'UTR中鑒定出2個(gè)GGAC基序（a）。作者使用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)野生型和Mettl3Mut /-細(xì)胞之間的WT-3'UTR，mut1-3'UTR和mut2-3-3UTR的Snail 3'UTR沒有翻譯差異（b，c）。表明3'UTR上的m6A甲基化可能不參與m6A修飾調(diào)控的Snail表達(dá)。之后作者構(gòu)建了Snail CDS/MUT的表達(dá)構(gòu)建體并進(jìn)行相關(guān)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Snail在Mettl3Mut /-細(xì)胞中的表達(dá)顯著下降（而Mut則沒有如此明顯效果），表明CDS中的m6A甲基化與m6A介導(dǎo)的Snail表達(dá)至關(guān)重要（d，e，f）。

由于YTHDF1可充當(dāng)m6A“閱讀器”，識(shí)別m6A甲基化的mRNA，并促進(jìn)其靶標(biāo)的翻譯。作者使用RIP-qPCR研究了Snail mRNA和YTHDF1之間的相互作用。結(jié)果顯示，YTHDF1顯著富集了Snail mRNA（CDS區(qū)），而在Mettl3Mut /-細(xì)胞中，這種相對富集（IP與input）顯著受到抑制（g，h）。si-YTHDF1減弱了HeLa細(xì)胞中TGF-β誘導(dǎo)的Snail表達(dá)（i）。綜上證明YTHDF1參與SNAI1 mRNA的m6A甲基化。

接著使用RIP-qPCR檢測HeLa細(xì)胞中eEF-1-和eEF-2（翻譯延伸因子）結(jié)合Snail mRNA的變化。與Mettl3WTHeLa相比，Mettl3Mut /-HeLa細(xì)胞中Snail mRNA和eEF-2之間的結(jié)合顯著減少（j）。CoIP分析表明，與Mettl3WTHeLa相比，Mettl3Mut / -HeLa細(xì)胞中的YTHDF1和eEF-2之間的結(jié)合顯著降低（k）。綜上表明YTHDF1和eEF-2可能是癌細(xì)胞中m6A誘導(dǎo)的Snail mRNA的翻譯延伸的原因。

綜上，METTL3使 Snail mRNA不穩(wěn)定且降解而蛋白水平上調(diào)。究其原因可能是因?yàn)榉g延伸效率提高的原因，使得疊加調(diào)控結(jié)果為對Snail蛋白水平起正調(diào)控的作用。

（這一點(diǎn)在我們在日常的實(shí)驗(yàn)中也會(huì)經(jīng)常遇到，所以先不要總是懷疑自己的數(shù)據(jù)，如果做了幾次重復(fù)仍然是一樣的結(jié)果，那么我們要接受它，并嘗試找出其它原因。）

Fig6. m6A調(diào)節(jié)體內(nèi)癌癥的進(jìn)展

之后作者研究了m6A甲基化對癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的潛在影響。作者將sh-Con和sh Mettl3 Huh7細(xì)胞分別皮下注射到雌性裸鼠中。IHC結(jié)果表明METTL3耗竭使異種移植腫瘤組織中的Snail，F(xiàn)N和Vim含量降低（a），表明METTL3敲降可以降低Huh7細(xì)胞的EMT潛力和Snail表達(dá)。為了進(jìn)一步確定m6A甲基化對體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響，作者進(jìn)行了肺轉(zhuǎn)移分析。與對照細(xì)胞相比，從METTL3 sh Huh7細(xì)胞衍生的肺腫瘤數(shù)目顯著減少（b），表明METTL3缺乏抑制了體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移。然后將HeLa WT、Mettl3 Mut /-HeLa、HeLa Snail、HeLa Snail+Mettl3-注入裸鼠尾靜脈靜脈注射，結(jié)果顯示與HeLa WT細(xì)胞相比，源自Mettl3Mut /-HeLa細(xì)胞的肺的腫瘤數(shù)量明顯減少，而Snail的過度表達(dá)可以減弱Mettl3Mut /-HeLa細(xì)胞對體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的抑制作用（c）。提示Snail參與了METTL3的體內(nèi)轉(zhuǎn)移作用。

最后的最后，作者進(jìn)行了臨床數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，在肝腫瘤組織中觀察到METTL3（h）和YTHDF1（d）表達(dá)增加，且與肝臟中的Snail mRNA水平正相關(guān)（f，g）。高M(jìn)ETTL3（i），YTHDF1（j）和SNAI1（k）表達(dá)的肝癌患者顯示總生存期（OS）降低。