RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)步驟流程詳解
2024-08-08 16:39:43
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
RIP（RNA Immunoprecipitation）實(shí)驗(yàn)是一種基于抗體的技術(shù)，用于研究體內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。該實(shí)驗(yàn)通過捕獲特定RNA結(jié)合蛋白（RBP）及其結(jié)合的RNA，然后鑒定這些RNA的種類，從而揭示RNA-蛋白質(zhì)相互作用的細(xì)節(jié)下面，普拉特澤生物為廣大科研人員提供長期穩(wěn)定的番紅固綠染色外包實(shí)驗(yàn)服務(wù)，普拉特特生物將詳細(xì)闡述RIP實(shí)驗(yàn)的基本步驟流程，以期為科研小白們提供一個清晰、系統(tǒng)的操作指南。
一、細(xì)胞裂解
①準(zhǔn)備細(xì)胞：將細(xì)胞培養(yǎng)至狀態(tài)良好，吸除培養(yǎng)基。
②清洗細(xì)胞：用10 mL冰冷的PBS洗滌培養(yǎng)瓶或平板上的細(xì)胞兩次，以去除培養(yǎng)基和其他雜質(zhì)。
③收集細(xì)胞：加入10 mL冰冷的PBS，用細(xì)胞刮從培養(yǎng)瓶或平板上刮下細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到離心管中。
④離心收集：在4℃下以1500 rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞并丟棄上清液。
⑤裂解細(xì)胞：用與細(xì)胞等體積的RIP裂解緩沖液重新懸浮細(xì)胞顆粒，通過上下移液混合直至細(xì)胞被分散，混合物呈現(xiàn)均勻。將裂解液放在冰上孵育5分鐘，使低滲RIP緩沖液膨脹細(xì)胞。
⑥分裝保存：將每個裂解液的約200 μL分配到無核酸酶的微離心管中，并在-80℃下保存。
二、磁珠準(zhǔn)備
Ⅰ.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：確保所有實(shí)驗(yàn)用品（如enpendoff管、磁力架、槍頭、RIP Wash Buffer等）已準(zhǔn)備好并置于冰上。
Ⅱ重懸磁珠：將磁珠重懸并標(biāo)記實(shí)驗(yàn)所需的enpendoff管，包括目的樣品、陰性對照與陽性對照。
Ⅲ清洗磁珠：每管加入50 μl重懸后的磁珠懸液和500 μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后置于磁力架上，左右轉(zhuǎn)動15°使磁珠吸附成一條直線，去上清，重復(fù)一次。
Ⅳ抗體孵育：用100 μl的RIP Wash Buffer重懸磁珠，加入約5 μg相應(yīng)抗體于每個樣品中，室溫孵育30分鐘。
Ⅴ再次清洗：孵育后，將enpendoff管置于磁力架上，棄上清，加入500 μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后棄上清，重復(fù)一次，然后置于冰上。
三、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀
→準(zhǔn)備緩沖液：制備RIP Immunoprecipitation Buffer。
→混合裂解液與磁珠：將上一步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900 μl RIP Immunoprecipitation Buffer。迅速解凍細(xì)胞裂解液，在4℃下以14000 rpm離心10分鐘，吸取100 μl上清液于磁珠-抗體復(fù)合物中，使總體積為1 ml。
→孵育：在4℃下旋轉(zhuǎn)孵育3小時至過夜。
→清洗：孵育完后，短暫離心，將enpendoff管放在磁力架上，棄上清，加入500 μl RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后棄上清，重復(fù)清洗6次。
四、RNA純化
▲準(zhǔn)備Proteinase K Buffer：每個樣品需150 μl Proteinase K Buffer。
▲消化蛋白質(zhì)：用150 μl Proteinase K Buffer重懸磁珠-抗體復(fù)合物，55℃孵育30分鐘。孵育完后，將enpendoff管置于磁力架上，將上清液吸入一新的enpendoff管中。
▲提取RNA：于每管上清液中加入250 μl RIP Wash Buffer，再加入400 μl苯酚:氯仿:異戊醇（125:24:1），渦旋震蕩15秒，室溫下以14000 rpm離心10分鐘。小心吸取上層水相，重復(fù)氯仿抽提一次，最后加入無水乙醇沉淀RNA。
▲清洗與溶解：用80%乙醇清洗沉淀，晾干后重新懸浮在10到20 μL的無RNase的水中，并置于-80℃保存。
五、QPCR檢測
▲配制反應(yīng)體系：根據(jù)qPCR實(shí)驗(yàn)要求配制反應(yīng)體系。
▲RT反應(yīng)：將RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，生成cDNA。
▲qPCR檢測：將cDNA樣品進(jìn)行qPCR檢測，分析目標(biāo)RNA的表達(dá)情況。
六、實(shí)驗(yàn)后篇章：數(shù)據(jù)分析，洞見未來
1. RNA質(zhì)量檢測與測序 對提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量評估，確保無降解且純度達(dá)標(biāo)。隨后，可采用高通量測序技術(shù)（如RNA-seq）對RNA進(jìn)行深度分析，揭示其序列信息及可能的互作對象。
2. 數(shù)據(jù)解讀與生物信息學(xué)分析 借助生物信息學(xué)工具，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對、注釋和差異分析，識別出與特定RNA顯著互作的蛋白質(zhì)或RNA分子。結(jié)合已有文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫資源，構(gòu)建RNA互作網(wǎng)絡(luò)模型。
3. 驗(yàn)證與拓展 通過體外實(shí)驗(yàn)（如EMSA、Pull-down）或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（如CRISPRi/a）驗(yàn)證RIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并進(jìn)一步探究互作機(jī)制及其在生物體內(nèi)的功能意義。
七、結(jié)語
RIP實(shí)驗(yàn)，作為研究RNA互作網(wǎng)絡(luò)的金鑰匙，正引領(lǐng)著生命科學(xué)領(lǐng)域的新一輪探索熱潮。從精心準(zhǔn)備到精準(zhǔn)操作，再到深入的數(shù)據(jù)分析與驗(yàn)證，每一步都凝聚著科研工作者的智慧與汗水。讓我們攜手并進(jìn)，在RNA互作的廣闊天地中，不斷發(fā)現(xiàn)新知，推動生命科學(xué)向前發(fā)展！
要資質(zhì)有資質(zhì)
要經(jīng)驗(yàn)有經(jīng)驗(yàn)
要案例有案例
好，RIP實(shí)驗(yàn)步驟就介紹到這里啦~
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