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    前兩篇我們總結(jié)了chip實(shí)驗(yàn)中ChIP-seq 與 ChIP 實(shí)驗(yàn)的區(qū)別、chip實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差等常見問題，今天來學(xué)習(xí)chip實(shí)驗(yàn)操作時(shí)最容易碰見一些問題吧，希望大家引以為鑒，能夠避免這些普拉特澤為大家踩過的坑。

上篇：ChIP-seq 與 ChIP 實(shí)驗(yàn)的區(qū)別，一篇文章講清楚

中篇：ChIP 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差？教你 3 個(gè)提高實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的秘訣

   鏈接奉上，大家快點(diǎn)踩著普拉特澤的肩膀去摘蘋果吧！那現(xiàn)在我們來接著總結(jié)：

一、ChIP實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

關(guān)鍵試劑與設(shè)備

• 抗體：驗(yàn)證過的ChIP級(jí)抗體（建議查閱CiteAb或廠商驗(yàn)證數(shù)據(jù)）

• 交聯(lián)試劑：1%甲醛（活細(xì)胞）或DSG+甲醛（難交聯(lián)蛋白）

• 超聲破碎儀：確保DNA片段化至200-500bp（關(guān)鍵步驟?。?/p>

• 磁珠：Protein A/G磁珠（根據(jù)抗體宿主物種選擇）

樣本處理注意事項(xiàng)

• 細(xì)胞量：通常需1×10^6~1×10^7個(gè)細(xì)胞/IP

• 交聯(lián)時(shí)間：甲醛10-15分鐘（過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致抗原遮蔽）

• 終止交聯(lián)：用125mM甘氨酸淬滅10分鐘

2. ChIP實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟

Step 1: 染色質(zhì)片段化

• 超聲條件優(yōu)化：

• 使用Bioruptor或Covaris超聲儀

• 輸出功率：30%振幅，30s ON/30s OFF，循環(huán)6-8次

• 關(guān)鍵驗(yàn)證：跑膠檢測(cè)片段大?。繕?biāo)200-500bp）

Step 2: 免疫沉淀（IP）

• 抗體用量：1-5μg/IP（需預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化）

• 孵育條件：4℃旋轉(zhuǎn)過夜（避免非特異性結(jié)合）

• 洗滌緩沖液：

• Low Salt Wash Buffer (150mM NaCl)

• High Salt Wash Buffer (500mM NaCl)

• LiCl Wash Buffer (250mM LiCl)

Step 3: 解交聯(lián)與DNA純化

• 解交聯(lián)：65℃ 4-6小時(shí)（含蛋白酶K）

• 純化：采用酚 - 氯仿抽提法或商用 DNA 純化試劑盒

Step 4: 數(shù)據(jù)分析

• qPCR驗(yàn)證：設(shè)計(jì)目標(biāo)區(qū)域引物（陽(yáng)性/陰性對(duì)照必需）

• 測(cè)序準(zhǔn)備：文庫(kù)構(gòu)建適用于ChIP-seq