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普拉特澤生物為廣大生命科學(xué)研究人員提供 EdU 細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)服務(wù)，可根據(jù)實(shí)方案的要求選擇不同的檢測方法，本文就跟大家一起繼續(xù)探究EdU-CCK8雙軌驗(yàn)證細(xì)胞活性與增殖~~

單一檢測指標(biāo)常導(dǎo)致假陽性/假陰性誤判——CCK8僅反映代謝活性，無法區(qū)分靜息細(xì)胞；EdU只標(biāo)記DNA合成，可能漏檢凋亡干擾。普拉特澤生物開發(fā)的EdU-CCK8雙軌驗(yàn)證方案，可在96/384孔板中同步解析細(xì)胞真實(shí)增殖狀態(tài)與存活率，精準(zhǔn)識別抑制增殖型、細(xì)胞毒型、代謝干擾型藥物，誤判率降低90%

（一）、單指標(biāo)檢測的致命缺陷

█ 傳統(tǒng)單指標(biāo)陷阱

█ EdU-CCK8雙軌驗(yàn)證的核心價值

同步獲取兩大維度數(shù)據(jù)：

EdU?% = 真實(shí)增殖細(xì)胞比例

CCK8活性 = 總存活細(xì)胞量

計算黃金指標(biāo)：

增殖活力指數(shù) (PVI) = (EdU?% × CCK8 OD值) / 對照組值 × 100%

→ ＜30%：強(qiáng)效抑制增殖藥物

→ 30-70%：中度抑制

→ ＞70% 且 CCK8 活性驟降：提示藥物存在細(xì)胞毒作用

（二）、高通量雙軌方案全流程（96孔板為例）

█ 實(shí)驗(yàn)設(shè)計模板

█ 分步避坑指南

Step 1: 細(xì)胞鋪板與給藥

細(xì)胞密度優(yōu)化：

→腫瘤細(xì)胞：2000-5000/孔（24h后達(dá)30%融合度）

→原代細(xì)胞：5000-8000/孔

關(guān)鍵細(xì)節(jié)：

→邊緣孔填充PBS防蒸發(fā)→ 避免“邊緣效應(yīng)”

→設(shè)三重復(fù)孔 + 無細(xì)胞背景孔 + DMSO溶劑對照

Step 2: EdU脈沖標(biāo)記

時機(jī)：藥物處理結(jié)束前2小時加入EdU

濃度：

●快速增殖細(xì)胞：10μM EdU

●慢周期細(xì)胞：20μM EdU

避坑：用預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基稀釋EdU，防止血清干擾

Step 3: CCK8檢測（先測活細(xì)胞）

每孔加10μl CCK8試劑（終濃度10%）

37℃孵育1-4小時（顯色避光）

酶標(biāo)儀檢測450nm吸光度（參比650nm）

注意：顯色后立即檢測，避免甲臢沉淀

Step 4: EdU固定與染色

溫和固定：每孔加40μl 4% PFA（室溫15min）

通透處理：0.5% Triton X-100（PBS配制）20min

Click反應(yīng)：

——每孔加50μl Click反應(yīng)液（含AF647染料）

配方：

* 1mM CuSO?

* 2mM 抗壞血酸鈉

* 5μM AF647-azide

* 溶于PBS（現(xiàn)配現(xiàn)用）

避光孵育30min，PBS洗2次

Step 5: 高通量成像分析

設(shè)備：自動熒光顯微鏡（如Molecular Devices ImageXpress）

參數(shù)：

激發(fā)/發(fā)射：640nm/680nm（EdU-AF647）

掃描：每孔取9視野（覆蓋中心與邊緣）

軟件分析：

EdU?細(xì)胞數(shù)：通過 MetaXpress/MIAs 軟件自動識別熒光陽性細(xì)胞核計數(shù)

細(xì)胞總數(shù)：DAPI/Hoechst染色計數(shù)

增殖率 = EdU?細(xì)胞數(shù) / 總細(xì)胞數(shù) × 100%

（三）、雙軌數(shù)據(jù)解讀與藥物作用模式鑒定

█ 四類藥物的特征響應(yīng)

案例：紫杉醇處理乳腺癌MCF-7細(xì)胞

• 數(shù)據(jù)：EdU?%下降80%，CCK8僅降20%

• 結(jié)論：屬于強(qiáng)效抑制增殖型（阻滯M期），而非細(xì)胞毒性

（四）、關(guān)鍵優(yōu)化點(diǎn)與避坑策略

1. 時序沖突破解：先CCK8后EdU染色

• 矛盾點(diǎn)：CCK8含甲臢染料→淬滅熒光

• 方案：
  先測CCK8吸光度 → 移除CCK8液 → PBS洗1次 → 再固定染色

2. 孔間交叉污染預(yù)防

• 移液技巧：使用多通道移液器+低吸附槍頭

• 防蒸發(fā)：鋪板后覆蓋透氣密封膜（如Breathe-Easy）
  

• （五）、實(shí)戰(zhàn)案例：抗纖維化藥物篩選

• █ 模型：肝星狀細(xì)胞LX-2（誘導(dǎo)纖維化）

• 藥物庫：200種天然化合物

• 雙軌結(jié)果：

• →化合物A：EdU?%↓70%，CCK8↓10% → 抑制增殖候選藥

• →化合物B：EdU?%↑20%，CCK8↓60% → 細(xì)胞毒性（棄用）

• →靶點(diǎn)驗(yàn)證：化合物A顯著下調(diào)α-SMA和Collagen I表達(dá)（Western blot）

• 六、升級方案：類器官與活細(xì)胞動態(tài)追蹤

• █ 三維類器官雙軌檢測

• 操作調(diào)整：

• EdU標(biāo)記后→ 類器官解離為單細(xì)胞 → CCK8檢測

• 或采用ATP檢測（如CellTiter-Glo?）替代CCK8

• 優(yōu)勢：模擬體內(nèi)微環(huán)境，預(yù)測臨床響應(yīng)更準(zhǔn)確

• █ 活細(xì)胞動態(tài)監(jiān)測（IncuCyte?整合）

• EdU標(biāo)記期間啟動延時成像

• 自動追蹤：

• ▲細(xì)胞增殖：EdU?細(xì)胞數(shù)變化

• ▲細(xì)胞死亡：膜通透性染料（如Sytox Green）

• ▲結(jié)果輸出：增殖-死亡動態(tài)曲線（識別藥物作用時間窗）
  

• EdU-CCK8雙軌驗(yàn)證通過同步捕獲DNA合成與代謝活性，徹底規(guī)避單指標(biāo)誤判風(fēng)險。結(jié)合96/384孔板自動化操作與智能算法分析，可在7天內(nèi)完成千級化合物庫的精準(zhǔn)初篩，誤判率＜5%。隨著類器官與活細(xì)胞成像技術(shù)的整合。

• 要資質(zhì)有資質(zhì)

• 要經(jīng)驗(yàn)有經(jīng)驗(yàn)

• 要案例有案例

• 好，EdU-CCK8雙軌驗(yàn)證細(xì)胞活性與增殖就介紹到這里啦~

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