EdU細(xì)胞增殖檢測標(biāo)準(zhǔn)化操作流程流式+熒光雙平臺兼容
2025-06-24 18:09:57
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
本文就給小白們從簡介原理分類方法細(xì)細(xì)講講，梳理夯實一下基礎(chǔ)。讓大家充分掌握EdU細(xì)胞增殖檢測標(biāo)準(zhǔn)化操作流程！
普拉特澤生物本篇詳解了流式細(xì)胞術(shù)與熒光顯微鏡雙平臺兼容方案，涵蓋原理、試劑、詳細(xì)步驟、關(guān)鍵注意事項及結(jié)果分析，助力獲得準(zhǔn)確可重復(fù)的細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)。適用于腫瘤、干細(xì)胞、藥物篩選等研究。
簡介：
EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）檢測法因其操作簡便、靈敏度高、無需變性DNA、與多種檢測平臺兼容（尤其是流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡）等優(yōu)勢，已成為BrdU的理想替代方案。實現(xiàn)流式細(xì)胞術(shù)（定量分析細(xì)胞群體）與熒光顯微鏡（提供形態(tài)學(xué)定位信息）雙平臺的兼容性，能更全面、深入地解讀細(xì)胞增殖狀態(tài)。
本標(biāo)準(zhǔn)化操作流程旨在提供一套清晰、可靠且經(jīng)過優(yōu)化的實驗方案。
（一） 實驗?zāi)康?/span>
準(zhǔn)確檢測和定量分析體外培養(yǎng)細(xì)胞的增殖活性。
實現(xiàn)同一批EdU標(biāo)記樣本可同時用于流式細(xì)胞術(shù)（定量）和熒光顯微鏡（定性/半定量及形態(tài)學(xué)觀察）分析。
建立標(biāo)準(zhǔn)化流程，確保實驗結(jié)果的可重復(fù)性和可比性。
（二）實驗原理
EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物。在細(xì)胞增殖的S期，EdU能摻入新合成的DNA鏈中。隨后，通過高效的“點擊化學(xué)”反應(yīng)（通?；贑u(I)催化或更溫和的無銅催化體系），EdU分子上的乙炔基與連接有熒光染料（如Alexa Fluor 488, 594, 647等）的疊氮化物共價結(jié)合。
這種特異性的結(jié)合使得摻入了EdU的DNA被熒光標(biāo)記，從而可在流式細(xì)胞儀上定量分析增殖細(xì)胞比例
或在熒光顯微鏡下直觀觀察增殖細(xì)胞的分布與形態(tài)。
（三） 實驗材料與試劑
細(xì)胞： 待測細(xì)胞系或原代細(xì)胞。
培養(yǎng)基： 細(xì)胞相應(yīng)的完全培養(yǎng)基。
▲EdU工作液： 推薦使用商品化的EdU試劑盒（如Click-iT? Plus EdU系列）。通常需用預(yù)熱的不含血清培養(yǎng)基或PBS配制合適濃度（常用終濃度10-50 μM，需預(yù)實驗優(yōu)化）。
▲固定液： 含3-4%多聚甲醛的PBS（新鮮配制或使用商品化固定液）。兼容關(guān)鍵： 適用于雙平臺。
▲透化/封閉液： 含0.5-1% Triton X-100（或Saponin）和1-3% BSA（或合適血清）的PBS。兼容關(guān)鍵： 適用于雙平臺。
▲點擊化學(xué)反應(yīng)緩沖液： 核心兼容試劑！ 必須選擇試劑盒中明確標(biāo)明同時兼容流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光(IF/IHC) 的組分。包含：
CuSO?溶液 (如適用)
●熒光染料疊氮化物 (如Alexa Fluor? 488 Azide, AF594 Azide, AF647 Azide - 根據(jù)平臺和儀器通道選擇)
●緩沖液添加劑/反應(yīng)緩沖液 (確保流式信號強(qiáng)度與顯微背景可控)
●點擊反應(yīng)催化劑/加速劑 (如用于無銅催化的試劑)
●DAPI或Hoechst 33342： 細(xì)胞核復(fù)染劑（用于熒光顯微鏡定位）。
流式染色緩沖液： 含1% BSA的PBS（用于流式樣本重懸）。
耗材： 細(xì)胞培養(yǎng)板/皿、離心管、移液器及吸頭、冰盒、計時器、封口膜/Parafilm。
儀器：
①流式細(xì)胞儀 (配備相應(yīng)激光器和濾光片以檢測所選熒光染料)
②熒光顯微鏡 (配備相應(yīng)激發(fā)/發(fā)射濾光塊以檢測所選熒光染料和核染料)
（四） 標(biāo)準(zhǔn)化操作流程 (雙平臺兼容核心)
細(xì)胞鋪板與培養(yǎng)：
將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以合適密度接種于培養(yǎng)板（用于顯微鏡觀察，如玻底培養(yǎng)皿或爬片）或培養(yǎng)皿（用于流式收集）中。確保實驗組和對照組設(shè)置合理。
在37°C, 5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜或至細(xì)胞達(dá)到約60-80%匯合度（具體密度需優(yōu)化）。
EdU標(biāo)記：
吸棄舊培養(yǎng)基。
⒈加入預(yù)熱的EdU工作液： 用預(yù)熱（37°C）的無血清培養(yǎng)基或PBS稀釋商品化EdU儲備液至所需終濃度（務(wù)必進(jìn)行濃度梯度預(yù)實驗優(yōu)化）。輕柔加入覆蓋細(xì)胞。
孵育： 將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱，孵育適當(dāng)時間（通常1-4小時，取決于細(xì)胞周期長短和研究目的，需優(yōu)化）精確計時。
終止標(biāo)記與清洗：
小心吸棄含EdU的培養(yǎng)液。
快速清洗： 用預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（含血清）或PBS輕柔洗滌細(xì)胞2-3次，每次1-2分鐘，以終止標(biāo)記并去除未摻入的EdU。動作需輕柔，避免細(xì)胞脫落（尤其流式樣本）。
細(xì)胞固定：
吸棄清洗液。
ⅰ加入固定液： 加入足量（完全覆蓋細(xì)胞）預(yù)冷的3-4%多聚甲醛/PBS。
ⅱ室溫固定： 在室溫下避光固定15-30分鐘（避免過度固定）。
ⅲ清洗： 吸棄固定液，用PBS輕柔洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘?？捎?°C PBS中保存數(shù)天（避光），但建議盡快進(jìn)行后續(xù)步驟。
細(xì)胞透化與封閉：
吸棄PBS。
⑴加入透化/封閉液： 加入足量含0.5-1% Triton X-100 (或Saponin) 和1-3% BSA (或血清)的PBS。
⑵室溫孵育： 避光孵育30-60分鐘。此步驟使試劑穿透細(xì)胞膜/核膜，并封閉非特異性結(jié)合位點，對降低背景至關(guān)重要，尤其顯微鏡觀察。
點擊化學(xué)反應(yīng) (核心步驟 - 兼容性關(guān)鍵)：
吸棄透化/封閉液。
配制點擊反應(yīng)混合液： 嚴(yán)格按照所選兼容試劑盒的說明書進(jìn)行配制！ 通常按比例混合：
緩沖液
CuSO?溶液 (如使用銅催化體系)
熒光染料疊氮化物 (選擇合適顏色，如AF488用于綠色通道/FITC通道，AF594用于紅色通道/PE通道，AF647用于遠(yuǎn)紅通道/APC通道)
反應(yīng)加速劑/催化劑 (如含硫配體的溶液用于銅催化，或?qū)Ｓ脽o銅催化劑)
確保混合液充分混勻且現(xiàn)配現(xiàn)用
①加入反應(yīng)液： 將配制好的點擊反應(yīng)混合液輕柔加入細(xì)胞中，確保完全覆蓋。
②避光孵育： 室溫下避光孵育30分鐘（具體時間參照試劑盒說明，無銅體系可能需更長時間）。嚴(yán)格控制反應(yīng)時間。
清洗：
吸棄點擊反應(yīng)液。
③徹底清洗： 用含1% BSA的PBS（或試劑盒推薦的洗滌緩沖液）輕柔洗滌細(xì)胞3-4次，每次5-10分鐘，充分去除未反應(yīng)的熒光染料和試劑，這是降低背景的關(guān)鍵步驟
用含 1% BSA 的 PBS（或試劑盒推薦的專用洗滌緩沖液）輕柔洗滌細(xì)胞 3-4 次，每次 5-10 分鐘，以充分去除未反應(yīng)的熒光染料及殘留試劑，該步驟是降低非特異性背景的關(guān)鍵
對熒光顯微鏡觀察尤為重要，可在最后一次清洗液中加入DAPI (1 μg/mL) 進(jìn)行核染（用于顯微鏡樣本）。
樣本分流與平臺特異性處理：
流式細(xì)胞術(shù)樣本：
對于貼壁細(xì)胞（如培養(yǎng)皿中）：用胰酶（不含EDTA或含低濃度EDTA）或細(xì)胞刮刀小心消化/刮下細(xì)胞。轉(zhuǎn)移至流式管。
對于懸浮細(xì)胞：直接收集至流式管。
⑴用預(yù)冷的流式染色緩沖液（含1% BSA的PBS）重懸細(xì)胞，300-500g離心5分鐘，棄上清。
⑵用適量（如300-500 μL）流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，過細(xì)胞篩（如40μm尼龍網(wǎng)）。
⑶立即上機(jī)分析或4°C避光保存（通常不超過24小時）。
熒光顯微鏡樣本：
對于培養(yǎng)板/玻底皿中的細(xì)胞：吸棄最后一次清洗液（或含DAPI的清洗液）。
封片： 加入少量抗淬滅封片劑（如ProLong? Gold, Vectashield?），小心蓋上蓋玻片，避免氣泡。封口膜封邊。
避光保存： 4°C避光保存，盡快觀察（數(shù)天內(nèi)）。
（五）、 數(shù)據(jù)采集與分析
流式細(xì)胞術(shù)：
⒈設(shè)置流式細(xì)胞儀：使用未標(biāo)記EdU的平行處理樣本（陰性對照）調(diào)節(jié)電壓和補(bǔ)償。
⒉獲取數(shù)據(jù)：收集足夠數(shù)量的事件（通常>10,000個細(xì)胞）。
⒊分析：圈定目標(biāo)細(xì)胞群（如FSC/SSC門排除碎片和死細(xì)胞），在EdU熒光通道（如FITC對應(yīng)AF488）設(shè)門。計算EdU陽性細(xì)胞百分比、平均熒光強(qiáng)度(MFI)等?？山Y(jié)合DNA染料（如7-AAD, DAPI）分析細(xì)胞周期（需在透化步驟后額外染色）。
熒光顯微鏡：
使用配備相應(yīng)濾光塊的熒光顯微鏡觀察。
EdU信號： 觀察特定熒光通道下的陽性信號（明亮的點狀或彌散核內(nèi)信號）。
細(xì)胞核： 觀察DAPI/Hoechst通道下的藍(lán)色核染色。
分析：可定性觀察增殖細(xì)胞的分布模式（如特定區(qū)域富集）、細(xì)胞形態(tài)（如分裂期形態(tài)）?？蛇M(jìn)行半定量分析，如在不同視野計數(shù)EdU陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例（需保證細(xì)胞密度和視野選擇的一致性），或使用圖像分析軟件進(jìn)行定量。
（六）、關(guān)鍵注意事項與優(yōu)化點 (標(biāo)準(zhǔn)化核心)
①EdU濃度與孵育時間： 必須預(yù)實驗優(yōu)化！ 濃度過高或時間過長可能導(dǎo)致非S期細(xì)胞背景染色或細(xì)胞毒性；過低或過短則信號弱。參考細(xì)胞周期時間。
②點擊化學(xué)試劑盒選擇： 務(wù)必選擇明確標(biāo)注“兼容流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光/免疫組化”的試劑盒。 不同平臺對反應(yīng)效率、背景控制要求不同。無銅催化體系通常背景更低，對細(xì)胞形態(tài)影響更小，更推薦用于顯微鏡，但部分也兼容流式。
③熒光染料選擇： 根據(jù)流式細(xì)胞儀激光器和濾光片配置以及顯微鏡濾光塊選擇合適波長的疊氮染料。確保與儀器兼容且避免光譜重疊。常用AF488(綠), AF594(紅), AF647(遠(yuǎn)紅)。
→固定： 使用新鮮配制的多聚甲醛，避免過度固定導(dǎo)致抗原表位遮蔽或自發(fā)熒光增加。
→透化： Triton X-100濃度和孵育時間需優(yōu)化。濃度過高或時間過長可能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（尤其顯微鏡樣本）；不足則試劑無法進(jìn)入。Saponin可逆性透化對某些抗原保存更好。
→封閉： 充分的封閉（BSA或血清）對降低非特異性背景至關(guān)重要，尤其在顯微鏡下觀察時。
→點擊反應(yīng)： 嚴(yán)格按試劑盒說明配制反應(yīng)液，確保各組分比例準(zhǔn)確。反應(yīng)時間需精確控制。
→清洗： 徹底清洗是降低背景的關(guān)鍵！ 特別是點擊反應(yīng)后和顯微鏡樣本封片前。
〖1〗對照設(shè)置： 必不可少！
〖2〗陰性對照： 不添加EdU，但進(jìn)行后續(xù)所有步驟（包括點擊反應(yīng)）。用于設(shè)門（流式）和確定背景水平（顯微鏡）。
〖3〗陽性對照： 已知高增殖率的細(xì)胞（如活化的淋巴細(xì)胞）。
〖4〗單染對照： 如果進(jìn)行多色分析（如EdU+細(xì)胞周期染料），需要單染樣本調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
〖5〗細(xì)胞狀態(tài)： 確保細(xì)胞處于良好狀態(tài)，避免過度融合或營養(yǎng)不良影響增殖。
〖6〗避光操作： 從EdU標(biāo)記開始，所有涉及熒光染料的步驟均需避光操作，防止熒光淬滅。
〖7〗平行處理： 用于雙平臺分析的樣本應(yīng)在同一批次實驗中用完全相同的試劑和條件進(jìn)行處理，以保證結(jié)果的可比性。
（七）、結(jié)果判讀與報告
清晰報告EdU標(biāo)記濃度、孵育時間、使用的具體試劑盒型號（尤其是點擊化學(xué)部分）、點擊反應(yīng)所用熒光染料、分析平臺（流式型號、顯微鏡型號及物鏡倍數(shù)）。
▲流式結(jié)果： 提供代表性流式圖（FSC/SSC, EdU vs. 其他參數(shù)如DNA含量）、EdU陽性細(xì)胞百分比、MFI、統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果。
▲顯微鏡結(jié)果： 提供代表性熒光圖片（需包含EdU通道、核通道、Merge圖），標(biāo)注比例尺。描述增殖細(xì)胞分布特征。如有半定量數(shù)據(jù)，報告計數(shù)方法及結(jié)果。
▲雙平臺關(guān)聯(lián)： 結(jié)合流式定量數(shù)據(jù)和顯微鏡形態(tài)學(xué)/定位信息，對細(xì)胞增殖狀態(tài)進(jìn)行更全面的解讀。例如，流式顯示某藥物處理組增殖率下降，顯微鏡可進(jìn)一步觀察是均勻抑制還是特定亞群受影響，或細(xì)胞是否呈現(xiàn)凋亡/壞死形態(tài)。
好啦，EdU細(xì)胞增殖檢測標(biāo)準(zhǔn)化操作流程我們就簡單介紹到這里啦，同學(xué)們有沒有一個簡單的了解呢？不懂得可以給客服留言技術(shù)給您詳細(xì)解答。下一篇再詳細(xì)為大家介紹藥物篩選高通量方案：EdU-CCK8雙軌驗證細(xì)胞活性與增殖，普拉特澤生物誓讓大家透徹EdU細(xì)胞增殖實驗的檢測過程。
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