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        大家好，今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是TUNEL染色實(shí)驗(yàn)的常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法。普拉特澤生物—病理實(shí)驗(yàn)平臺(tái)承接了大量的TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡代測(cè)實(shí)驗(yàn)與技術(shù)咨詢服務(wù)，同時(shí)在實(shí)操過(guò)程中也遇到了很多特殊的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，今天小編就把普拉特澤生物技術(shù)在用TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)遇到的各種問(wèn)題極其解決方法總結(jié)給大家，希望能在實(shí)驗(yàn)的操作中給到大家一定的幫助！

        問(wèn)題一、熒光信號(hào)弱或沒(méi)有熒光信號(hào)

   原因1：樣本處理不當(dāng)

        （1）樣本切片太厚。建議適當(dāng)將切片切薄一點(diǎn)，便于染色。

        （2）脫蠟和水化不充分。建議脫蠟先60 oC 20 min，再使用二甲苯兩次5-10 min；而水化用梯度乙醇從高到低濃度浸洗。

        （3）Proteinase K的孵育時(shí)間過(guò)短。優(yōu)化Proteinase K的孵育時(shí)間，常用時(shí)間10-30 min。4 μm左右的片子孵育10 min，30μm左右的片子孵育30 min。

        （4）Proteinase K濃度過(guò)低。建議蛋白酶K一般工作液濃度為20 μg/mL。

        （5）放置在-20 oC保存較長(zhǎng)時(shí)間的切片不新鮮，減低染色效率。建議使用新鮮切片。

         原因2：染色操作不當(dāng)

        （1）染色時(shí)間過(guò)短。建議一般 37 °c 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長(zhǎng)至2 h，但要結(jié)合背景著色。

        （2）TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度過(guò)低。建議適當(dāng)提高TdT酶或熒光素/酶標(biāo)記的dUTP濃度。

        （3）TdT酶失活。建議TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)致TdT酶失活。

        （4）樣本干燥。加上TUNEL反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片/保鮮膜/濕盒中進(jìn)行，保證樣本均勻染色，又可防止反應(yīng)液干燥。

         原因3：熒光檢測(cè)操作不當(dāng)

        主要是因?yàn)?/span>操作未避光。由于熒光易碎滅，建議標(biāo)記與檢測(cè)樣本時(shí)，載玻片要避光，觀察時(shí)要盡量快。

        問(wèn)題二、非特異性染色（假陽(yáng)性高）

        原因1：樣本處理不當(dāng)

        （1）使用酸性或堿性固定液，導(dǎo)致DNA損傷。建議使用pH中性的固定液固定組織或者細(xì)胞。

        （2）固定液濃度過(guò)高，導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽(yáng)性。建議使用4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）。

        （3）固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞自溶、DNA鏈不規(guī)則斷裂、造成假陽(yáng)性。建議控制固定時(shí)間在4 ℃放置25 min。

        （4）蛋白酶K處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。建議適當(dāng)縮短處理時(shí)間。

        （5）蛋白酶K濃度過(guò)大，破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽(yáng)性。建議適當(dāng)調(diào)整蛋白酶K溶液濃度，一般工作液濃度為20 μg/mL。

        原因2：染色操作不當(dāng)

        （1）TUNEL染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。建議一般是 37 °c 孵育60 min，可以根據(jù)凋亡損傷程度，可長(zhǎng)至2 h，但要結(jié)合背景著色。

        （2）未充分清洗樣本。染色后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來(lái)避免切片的非特異性染色。

        問(wèn)題三、熒光背景強(qiáng)

        原因1：樣本操作不當(dāng)

        （1）TUNEL染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。建議染色時(shí)間適當(dāng)，一般是 37 °c孵育60 min，避免串色。

        （2）TUNEL染色液濃度過(guò)大。建議增大稀釋倍數(shù)，優(yōu)化濃度。

        （3）PBS未充分清洗樣本。在TUNEL反應(yīng)后PBS清洗次數(shù)可增加到5次，來(lái)避免切片樣本中殘留的染料。

        原因2：熒光檢測(cè)操作不當(dāng)

        曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。建議調(diào)整曝光條件，先對(duì)陰性組調(diào)整到無(wú)背景光，然后用這個(gè)曝光條件去拍攝實(shí)驗(yàn)組（可以微調(diào)，但是不需要大調(diào)）。

        
       好啦，那TUNEL染色的幾個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題咱們就介紹到這里啦，您還有遇到其他的問(wèn)題，歡迎給我們留言，我們會(huì)回答后加到這片文章中跟大家一起學(xué)習(xí)哦！

        如果您有用TUNELl或流式代測(cè)細(xì)胞凋亡的需求的話，請(qǐng)相信——普拉特澤！