Question：WB 轉(zhuǎn)膜后怕白做？3 種快速判斷蛋白轉(zhuǎn)印的方法，10 秒就能出結(jié)果？（普拉特澤生物提供長期穩(wěn)定的wb實驗外包服務）
在Western Blot（WB）轉(zhuǎn)膜后，快速判斷蛋白是否成功轉(zhuǎn)印到膜上，可通過預染 Marker 驗證、膜染色、快速檢測試劑盒等方法實現(xiàn)，操作便捷且結(jié)果直觀。
最常用：利用預染蛋白Marker（Pre-stained Protein Marker）
這是實驗室最常規(guī)、無需額外操作的快速判斷方法，幾乎每個WB 實驗都會用到，核心是通過預染 Marker 的遷移情況驗證轉(zhuǎn)膜效率。預染Marker 在制膠時已加入染料（如藍色、紅色熒光染料），電泳時隨蛋白一起遷移，轉(zhuǎn)膜過程中會與樣本蛋白同步轉(zhuǎn)移到膜上。若膜上能觀察到清晰的預染 Marker 條帶，說明轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（電極、緩沖液、膜 / 濾紙貼合度）正常，蛋白已成功從膠轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜前：將預染Marker 加在凝膠的其中一個泳道（通常是最左側(cè) / 右側(cè)），與樣本蛋白一同進行 SDS-PAGE 電泳。轉(zhuǎn)膜后：無需任何處理，直接將轉(zhuǎn)印后的膜放在白色背景板（如濾紙、培養(yǎng)皿蓋）上，用肉眼或手機拍照觀察。判斷標準：若膜上出現(xiàn)與預染Marker 說明書一致的、清晰的條帶（無模糊、無拖尾、無明顯缺失），說明轉(zhuǎn)膜成功，且轉(zhuǎn)膜效率良好；若膜上無Marker 條帶，或條帶僅在凝膠上殘留（可將轉(zhuǎn)膜后的凝膠用考馬斯亮藍快速染色驗證），說明轉(zhuǎn)膜失敗（可能是電極接反、膜未激活、緩沖液失效等）。零額外步驟：無需染色、孵育，轉(zhuǎn)膜后直接觀察；快速：10 秒內(nèi)可判斷，不耽誤后續(xù)封閉、孵育流程；同時驗證轉(zhuǎn)膜方向：若Marker 條帶順序與電泳時一致（小分子在下、大分子在上），可排除 “膜與膠貼反” 的失誤。直接驗證總蛋白：麗春紅S（Ponceau S）染色
若需確認樣本總蛋白是否轉(zhuǎn)印到膜上（而非僅依賴Marker），可使用麗春紅 S 快速染色，該方法可逆，不影響后續(xù)抗體孵育。麗春紅S 是一種酸性染料，可與蛋白中的堿性氨基酸（如賴氨酸、精氨酸）結(jié)合，形成紅色條帶，且染色后可被水或 TBS 洗去，不干擾后續(xù) WB 檢測。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出膜，用去離子水或TBS 緩沖液快速沖洗 1-2 次（去除殘留轉(zhuǎn)膜緩沖液）；將膜浸泡在0.1% 麗春紅 S 染液（溶劑：5% 醋酸水溶液）中，室溫輕搖染色 1-3 分鐘；取出膜，用去離子水或TBS 緩慢沖洗 2-3 次（每次 10-20 秒），直至背景變淺、蛋白條帶清晰；觀察結(jié)果：將膜放在白色背景上，若能看到與樣本泳道對應的紅色條帶（條帶清晰度與樣本上樣量相關(guān)，上樣量越高越明顯），說明總蛋白已成功轉(zhuǎn)印；若無條帶，需排查轉(zhuǎn)膜問題。后續(xù)處理：確認后，用TBS 繼續(xù)沖洗膜 2-3 次，直至紅色完全褪去，即可進入封閉步驟（封閉液也會加速染料褪去）。直接反映總蛋白轉(zhuǎn)印情況：避免“Marker 轉(zhuǎn)印成功但樣本蛋白未轉(zhuǎn)印” 的特殊情況（如樣本蛋白未從膠中遷出）；可逆、無干擾：不影響后續(xù)抗體結(jié)合，無需額外處理；染色時間不宜過長：超過5 分鐘可能導致背景過深，條帶模糊；不適用于PVDF 膜長期保存：麗春紅 S 染色后若不及時沖洗，可能導致膜變脆。若需直接確認目標蛋白是否轉(zhuǎn)印成功（而非總蛋白），可使用商業(yè)化的“快速 Western 檢測試劑盒”，適合緊急驗證或少量樣本檢測。這類試劑盒通常包含“熒光標記的二抗 + 快速孵育緩沖液”，無需封閉步驟，可在 10-15 分鐘內(nèi)完成目標蛋白的檢測，本質(zhì)是簡化版的 WB 孵育流程，通過目標條帶的出現(xiàn)判斷轉(zhuǎn)印成功。轉(zhuǎn)膜后，用試劑盒配套的“快速緩沖液” 沖洗膜 1 次（替代封閉）；將膜浸泡在“目標蛋白一抗 + 快速緩沖液” 混合液中，室溫輕搖孵育 5-8 分鐘（一抗已預稀釋，無需額外稀釋）；用快速緩沖液沖洗膜2 次（每次 1 分鐘），去除未結(jié)合一抗；將膜浸泡在“熒光二抗 + 快速緩沖液” 混合液中，室溫輕搖孵育 3-5 分鐘；若出現(xiàn)與目標蛋白分子量一致的熒光條帶，說明目標蛋白已成功轉(zhuǎn)印；若無條帶，需結(jié)合Marker 和麗春紅染色排查是轉(zhuǎn)膜問題還是抗體問題。直接驗證目標蛋白：跳過總蛋白染色，直接確認目標蛋白轉(zhuǎn)印情況；快速：全程15-20 分鐘，遠快于常規(guī) WB（需數(shù)小時）；特異性高：僅結(jié)合目標蛋白，避免總蛋白染色的非特異性干擾。需提前準備目標蛋白一抗：需與試劑盒兼容的一抗（通常為兔源或鼠源）。檢查轉(zhuǎn)膜裝置：確認電極未接反（通?！澳z側(cè)接負極，膜側(cè)接正極”，蛋白帶負電向正極遷移）；若接反，蛋白會遷移到濾紙上而非膜上；膜的激活狀態(tài)：PVDF 膜需用甲醇浸泡 10-30 秒激活（打開膜的疏水通道，便于蛋白結(jié)合），若未激活，蛋白無法附著在膜上；硝酸纖維素膜（NC 膜）無需甲醇激活，若用甲醇處理反而會導致膜溶解；凝膠殘留檢測：轉(zhuǎn)膜后，將凝膠用考馬斯亮藍快速染色液（0.25% 考馬斯亮藍 R-250，溶劑：40% 甲醇 + 10% 醋酸）染色 5-10 分鐘，脫色后若凝膠上無明顯蛋白條帶（或條帶極淺），說明蛋白已大部分轉(zhuǎn)移到膜上；若凝膠上仍有清晰條帶，說明轉(zhuǎn)膜效率低（需延長轉(zhuǎn)膜時間、提高轉(zhuǎn)膜電流等）。WB 轉(zhuǎn)膜后可通過多種方法快速判斷蛋白轉(zhuǎn)印情況：預染 Marker 最常用，轉(zhuǎn)膜后直接觀察膜上條帶，10 秒內(nèi)出結(jié)果；麗春紅 S 染色能驗證總蛋白，染色后沖洗可逆，不影響后續(xù)實驗；快速 Western 試劑盒可直接確認目標蛋白，15-20 分鐘完成檢測。還能通過檢查裝置、膜激活狀態(tài)及凝膠殘留輔助排查問題，可按需選擇方法。
圖源自生物奇跡
如侵則刪
好，今天快速判斷蛋白轉(zhuǎn)印的方法
就說到這里
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2025-10-29 15:05:54
湘公網(wǎng)安備