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早期乳腺癌的癥狀多不明顯，晚期乳腺癌可發(fā)生癌細胞遠處轉移，出現全身多器官病變，直接威脅患者的生命。目前，患乳腺癌后的骨轉移是乳腺癌高死亡率的主要原因（70%占比），那是否有方法通過調節(jié)免疫特性，去減少轉移性生長呢？這篇發(fā)表于Cancer Research上的文章就為大家做了詳細的講解~

結論：

作者揭示了ERRα通過增加骨微環(huán)境的免疫活性來抑制乳腺癌細胞的骨轉移。乳腺癌骨轉移中ERRα的過表達誘導趨化因子CCL17和CCL20的表達，并抑制轉化生長因子β3（TGF-β3）的產生。隨后，募集到骨轉移的CD8 + T淋巴細胞逃脫了TGF-β信號的控制，并具有加劇的細胞毒性特征，從而大大減少了轉移。作者在小鼠中發(fā)現的臨床相關性在240多名乳腺癌患者中得到了證實。因此，這項研究表明，ERRα調節(jié)骨骼微環(huán)境中的免疫特性，有助于減少轉移性生長。

正文解讀

Fig1：在晚期乳腺癌中過表達ERRα模型抑制骨轉移發(fā)育

作者首先將4T1-CT；4T1-ERRα；4T1-CT（af2）；4T1-ERRαAF2細胞接種到BALB / c小鼠中。接種后13-15天，分析溶骨性病變。圖A~G為4T1-CT與4T1-ERRα對照組。圖H~N為4T1-CT（af2）與4T1-ERRαAF2對照組。

圖1 A：CT拍照，溶骨區(qū)用虛線劃分。

圖1 B：骨溶解顯示溶骨性病變的平均大小。

圖1 C、D：脛骨的矢狀切面(C)和橫切面(D)的三維微ct重建表示，跟隨骨沿平面的切割，在C中以虛線表示。

圖1 E：骨體積/組織顯示體積百分比。

圖1 F：三色染色后骨骼切片的組織學圖像。腫瘤用虛線和*表示骨髓。

圖1 G：腫瘤負荷/軟組織體積百分比。

結果顯示，在晚期乳腺癌中，ERRα過表達組的骨溶解減少，ERRαAF2（ERRα功能域突變）實驗組的骨溶解增加。

Fig2：晚期乳腺癌細胞中ERRα的過表達對肺轉移的發(fā)生沒有影響

圖2 A：細胞注射第15天HE染色后小鼠肺的組織學分析。轉移灶用* (B)圖表示3個不同深度的代表性切片上的肺轉移的癌細胞計數。

圖2 C-F：（C和E）壓碎來自用于定量骨轉移的同一只小鼠的肺，將釋放的細胞培養(yǎng)2周。肺轉移菌落的代表性圖片和(D和F)是說明所有小鼠形成的肺轉移菌落數量平均值的圖表。

圖2 G：顯示了2周后在肺轉移細胞集落ERRα的平均表達。半定量PCR對n=3只動物進行3個重復的PCR，并對核糖體蛋白基因L32進行歸一化。

考慮到4T1細胞也定居在肺中，作者分析了ERRα表達對LM發(fā)育的影響。結果與骨骼相反，從肺中提取的LM數量和BCa菌落數量均與4T1細胞中ERRα的表達水平無關。（A-F）但是與對照組相比，4T1-ERRα注射組中觀察到了LM中的ERRα過表達。

結合圖1、圖2的結果，揭示了乳腺癌細胞中ERRα的過度表達阻止了它們在骨骼中的生長，并提示了乳腺癌中ERRα的表達可能會影響骨骼微環(huán)境，從而阻止骨轉移進展。

Fig3：晚期乳腺癌細胞中ERRα的過表達促進CD8 + T細胞毒性作用

從接種了4T1-CT或4T1-ERRα細胞的小鼠（n = 4）的轉移腿（骨頭）（A，C，D-F）或肺（B，C）制備細胞懸液。

圖3 A-B：CD45 +造血細胞的流式細胞術等高線圖，顯示了T細胞（CD3 +），B細胞（CD19 +）和CD4 / CD8 T細胞的比例，以及代表骨骼中細胞百分比的圖（A）和肺部（B）。

圖3 C-E：流式細胞儀等高線圖說明了CD8 + T細胞中FasL（細胞凋亡因子），LAMP-1（溶酶體關聯膜蛋白），粒酶A和B（毒細胞檢測因子）以及IFN-β（腫瘤壞死生長因子）的產生。（D）圖形顯示細胞百分比，（E）顯示其絕對數。

圖3 F-G：TUNEL分析后表達骨的4T1-CT或4T1-ERRα切片的熒光顯微照片以及虛線矩形的放大圖。DAPI染色后，凋亡細胞顯示為紅色，細胞核顯示為藍色。（G，H）比例尺＝50μm，T：腫瘤，GP：具有凋亡性肥大性軟骨細胞的生長板，由白色箭頭表示。

將接種了4T1-C和4T1-ERRα細胞的小鼠的腿和肺制備細胞懸液。通過流式細胞儀檢

測B細胞、T細胞、毒性、炎癥因子、凋亡等指標的差異。結果顯示，ERRα在BCa細胞中的表達會影響T細胞在骨骼中錨定后的穩(wěn)態(tài)。與對照組相比，ERRα處理組發(fā)現明顯的細胞凋亡。

Fig4：CD8+ T細胞消耗恢復4T1-ERRα骨轉移進展

圖4 A：流式細胞術分析證實加入cd8抗體后，骨中CD8+T細胞缺失。

圖4 B：拍照顯示4T1-ERRα細胞接種18天后溶骨性病變情況。溶骨區(qū)用虛線劃分。

圖4 C-E：三維microCT重建脛骨的代表在矢狀部分(C)和橫截面(D)骨沿平面切割。(E)中的虛線所示圖表說明的意思是骨體積/組織體積。

結果表明，ERRα在BCa細胞中的表達會影響CD8 + T細胞的穩(wěn)態(tài)，并增加其在骨骼中的抗腫瘤細胞毒性程序，從而控制腫瘤的進展。

Fig5：ERRα在晚期乳腺癌細胞中上調Ccl17和Ccl20

圖5 A：細胞因子、趨化因子和生長因子mRNA在4T1- ERRα細胞和4T1-ct細胞中的表達，與Ppia、Actb和Rplp0的表達對照

圖5 B-D：為對3個重復樣本進行RT-PCR并對核糖體蛋白基因L32進行歸一化后的相關基因表達情況

圖5 E：分析了患有4T1-ERRα和4T1-CT病變的小鼠(n=3)粉碎骨骼后獲得的腫瘤細胞集落，并在4周內培養(yǎng)

圖5 F：4T1-ERRα和4T1-CT細胞定植的骨切片上Ccl17和Ccl20的免疫染色。T:腫瘤，GP:生長板。

圖5 G：流式細胞儀等高線圖顯示了CCR4和CCR6在4T1-ERRα細胞或4T1-CT細胞定植的骨CD8+T細胞上的表達。

結論：通過生信分析發(fā)現ERRα在晚期乳腺癌細胞中可上調下游Ccl17和Ccl20的表達，后續(xù)通過QPCR和免疫組化驗證。

Fig6：ERRα在晚期乳腺癌細胞中上調Ccl17和Ccl20

圖6 A：基于涉及免疫系統過程的蛋白質的基因本體學聯盟提取的信息覆蓋最小網絡（包含101種蛋白質），并創(chuàng)建“特定于對腫瘤的免疫應答的最小網絡”（包含52個蛋白質）

圖6 B-C：通過對串擾子的系統最短路徑定義，確定了ESRRA潛在的新調控因子VCAM1、MACF1、HUR和TGF-β3。

圖6 D：分析4T1-ERRα、4T1-ERRα-AF2、4T1-CT和4T1-CT(AF2)細胞

圖6 E：分析了患有4T1-ERRα或4T1-CT病變的小鼠(n = 3)粉碎骨骼后獲得的腫瘤細胞集落，并在4周內培養(yǎng)

圖6 F：Tgf-β3在4T1-ERRα；4T1-CT；4T1-CT（af2）；4T1-ERRαAF2細胞定植的骨切片上的免疫染色。

圖6 G：用反向激動劑XCT-790將4T1-ERRα細胞培養(yǎng)24小時后TGF-β表達量

圖6 H：對MCF7和B02克隆的mRNA進行RT PCR。顯示了每個MCF7克隆的三種不同培養(yǎng)物的TGF-β3平均值

圖6 I：流式顯示了4T1-ERRα細胞或4T1-CT定植的骨CD8+ T細胞中SMAD2/3的磷酸化。

基于創(chuàng)建的“特定于對腫瘤的免疫應答的最小網絡”（包含52個蛋白質），對串擾子的系統最短路徑定義，確定了兩個新的ESRRA（ERRα）-CCL17或ESRRA-CCL20相關的調節(jié)劑：VCAM和TGF-β 3。結果表明，ERRα的過表達抑制了BCa中TGF-β3的表達，因此可以防止BCa BM在免疫細胞中產生由TGF-信號激活提供的免疫抑制微環(huán)境。

整體結論如下：

1.ERRα在BCa細胞中的表達抑制骨轉移后的骨溶解；

2.BCa細胞ERRα的表達影響骨中的T細胞的穩(wěn)態(tài)；（募集T細胞）

3.ERRα表達導致BCa細胞中CCL17和CCL20的上調；

4.ERRα的過表達抑制了BCa中TGF-β3的表達，因此可以防止BCa BM在免疫細胞中產生由TGF-信號激活提供的免疫抑制微環(huán)境。