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    蛋白酶抑制劑是生物化學和分子生物學實驗中不可或缺的工具，主要用于防止蛋白質樣品在提取和純化過程中被內源性蛋白酶降解

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蛋白酶抑制劑是生物化學和分子生物學實驗中不可或缺的工具，主要用于防止蛋白質樣品在提取和純化過程中被內源性蛋白酶降解

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蛋白酶抑制劑是生物化學和分子生物學實驗中不可或缺的工具，主要用于防止蛋白質樣品在提取和純化過程中被內源性蛋白酶降解。那么常見的蛋白酶抑制劑有哪些呢？以下玉珠隆生物小編將對其進行整理并分享給各位小伙伴，希望對您有所幫助。

一、蛋白酶抑制劑的種類（按抑制的蛋白酶類型分類）

蛋白酶種類繁多，因此沒有一種“萬能”的抑制劑可以抑制所有蛋白酶。通常需要根據(jù)樣本類型和目標蛋白的特性，可選擇幾種抑制劑混合使用。

以下是針對主要蛋白酶類型的常用抑制劑：

1. 絲氨酸蛋白酶抑制劑

作用對象：胰蛋白酶（Trypsin）、胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）、凝血酶（Thrombin）等。

常見抑制劑：

PMSF（苯甲基磺酰氟）：最經(jīng)典、最常用的抑制劑。毒性極大，不穩(wěn)定，在水溶液中會快速失效（半衰期約30分鐘），必須在臨用前從乙醇或異丙醇儲備液中加入。

AEBSF：水溶性更好，毒性低于PMSF，且更穩(wěn)定，常作為PMSF的替代品。

Aprotinin（抑肽酶）：一種小分子蛋白質，可逆地抑制多種絲氨酸蛋白酶。

2. 半胱氨酸蛋白酶抑制劑

作用對象：組織蛋白酶（Cathepsin B, L）等。

常見抑制劑：

E64：高效、特異、不可逆的抑制劑。水溶性好，非常穩(wěn)定。

Leupeptin（亮抑蛋白酶肽）：可逆抑制劑，既能抑制部分半胱氨酸蛋白酶，也能抑制一些絲氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶）。

3. 天冬氨酸蛋白酶抑制劑

作用對象：胃蛋白酶（Pepsin）、組織蛋白酶D（Cathepsin D）、腎素（Renin）等。

常見抑制劑：

Pepstatin A：一種特異性很強的抑制劑，有效濃度很低（微摩爾級）。難溶于水，通常用甲醇或乙醇配制儲備液。

4. 金屬蛋白酶抑制劑

作用對象：膠原酶（Collagenase）、嗜熱菌蛋白酶（Thermolysin）、多種金屬內肽酶等。這類酶活性依賴于金屬離子（如Zn2?）。

常見抑制劑：

EDTA（乙二胺四乙酸）/ EGTA：通過螯合金屬離子（如Zn2?, Ca2?）來抑制酶活，并非直接作用于蛋白酶本身。是最常用的廣譜金屬蛋白酶抑制劑。

1,10Phenanthroline（鄰菲羅啉）：也是一種金屬離子螯合劑。

5. 氨基肽酶抑制劑

作用對象：從多肽鏈N端開始水解的蛋白酶。

常見抑制劑：

Bestatin：抑制氨基肽酶B和亮氨酸氨基肽酶。

EDTA：對某些金屬離子依賴的氨基肽酶也有效。

6. 蛋白酶體抑制劑

作用對象：26S蛋白酶體復合物。

常見抑制劑：

MG132：可逆抑制劑，廣泛用于細胞培養(yǎng)研究，以抑制蛋白質的泛素化蛋白酶體降解途徑。

Lactacystin：不可逆的特異性抑制劑。

二、使用方法

1. 基本原則：使用多種抑制劑混合物

由于樣本（如細胞、組織）中通常含有多種類型的蛋白酶，強烈建議使用復合型的蛋白酶抑制劑混合物，而不是單一抑制劑。這能確保對各類蛋白酶都有廣泛的抑制效果。

2. 兩種主要獲取方式：

商品化的預混抑制劑：

形式：通常是片劑（溶解于一定體積的裂解液中）或即用型溶液。

優(yōu)點：非常方便，比例經(jīng)過優(yōu)化，廣譜高效，避免了自行配制和稱量有毒試劑的麻煩。市面上有針對通用、哺乳動物細胞、細菌細胞、組蛋白提取等不同需求的專用混合劑。

推薦：對于常規(guī)實驗，這是最省時省力且可靠的選擇。

自行配制：

根據(jù)需要抑制的蛋白酶類型，從上述種類中選擇幾種，用合適的溶劑（如水、乙醇、DMSO等）配制成高濃度的儲備液，然后按比例添加到裂解液或緩沖液中。

優(yōu)點：成本較低，可根據(jù)特定需求靈活調整配方。

缺點：需自行稱量有毒試劑，優(yōu)化比例較麻煩。

3. 一個常用的基礎自行配制方案（僅供參考）：

對于常規(guī)的哺乳動物細胞/組織蛋白提取，比較常用的抑制劑組合是：

PMSF：1 mM （針對絲氨酸蛋白酶）

Aprotinin：0.31 μM或12 μg/mL

Leupeptin：0.55 μg/mL（針對半胱氨酸和部分絲氨酸蛋白酶）

Pepstatin A：1 μM（針對天冬氨酸蛋白酶）

EDTA：0.51 mM（針對金屬蛋白酶）

注意：所有儲備液均需分裝并于20°C保存。PMSF必須在裂解液臨用前加入。

4. 關鍵步驟和注意事項：

①.預冷：所有操作都應在4°C冰上進行，以降低蛋白酶活性。

②. 提前加入：蛋白酶抑制劑應在裂解開始前就添加到裂解緩沖液中，確保樣品一接觸裂解液就受到保護。

③. 濃度：遵循產(chǎn)品說明書或文獻建議的濃度，過高濃度可能影響后續(xù)實驗（如蛋白質功能研究、免疫沉淀等）。

④. 穩(wěn)定性：注意不同抑制劑的穩(wěn)定性。例如，含有PMSF的溶液應在3060分鐘內使用。

⑤. 后續(xù)步驟：在純化后期（如透析、柱洗脫）可能需要補充蛋白酶抑制劑，或在后續(xù)步驟中將其去除（如通過透析或脫鹽柱），以免干擾蛋白功能。

⑥. 特殊蛋白：對于磷酸化蛋白研究，需要添加磷酸酶抑制劑（如NaF、β甘油磷酸酯、原釩酸鈉等），因為蛋白酶抑制劑對磷酸酶無效。

⑦. 安全性：許多抑制劑（如PMSF）有劇毒，操作時應佩戴手套、護目鏡，并在通風櫥中進行。

小編建議：

對于新手或常規(guī)實驗，直接購買商品化的蛋白酶抑制劑，按說明書添加到裂解緩沖液中。這是最安全、高效的選擇。對于特定需求或大規(guī)模實驗，可以考慮自行配制，但務必注意安全，并參考文獻優(yōu)化配方。需要牢記的是：低溫操作與提前添加抑制劑是保護蛋白質樣品不被降解的兩個最關鍵因素。

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