上期的文獻(xiàn)分享，我們講了關(guān)于RNA甲基化一篇影響因子6分左右的SCI。今天，我們一起來看看影響因子12左右的文章怎么研究RNA甲基化的吧~
這次分享的文獻(xiàn)題目是：Loss of m6A demethylase ALKBH5 promotes post-ischemic angiogenesis via post-transcriptional stabilization of WNT5A，影響因子為11.492分，發(fā)表在2020年12月的RESEARCH ARTICLE 雜志上。
想了解高分文章是怎么研究RNA甲基化的伙伴們，現(xiàn)在就跟著我，踏著之前文獻(xiàn)解讀里整理的“標(biāo)準(zhǔn)步驟”往下看吧~
一、缺氧損害血管生成能力，巨細(xì)胞胚胎干細(xì)胞中ALKBH5表達(dá)上調(diào)
為了闡明m6A在缺血后血管生成中的作用，作者分離了心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）。CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CMECs的存活能力在缺氧3小時(shí)后開始增加，在12小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，在24小時(shí)后又顯著下降（Figure 1A）。EdU實(shí)驗(yàn)分析顯示，缺氧24小時(shí)后EdU陽性細(xì)胞的比例顯著降低（Figure1B-C）。此外，CMECs細(xì)胞的遷移、侵襲及血管形成能力在缺氧條件下亦顯著降低（Figure1B, D-F）。綜上，24小時(shí)缺氧抑制心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成能力。
m6A點(diǎn)斑實(shí)驗(yàn)表明缺氧使得CMECs中m6A豐度顯著降低（Figure 1G）。而RT-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶WTAP和去甲基化酶ALKBH5在缺氧損傷后其mRNA水平顯著上調(diào)（Figure 1H），但在缺氧CMECs中，只有m6A去甲基化酶ALKBH5的蛋白水平表達(dá)顯著上調(diào)（Figure1I -J）。
二、ALKBH5過表達(dá)加劇了缺氧誘導(dǎo)的巨細(xì)胞的細(xì)胞功能障礙
接下來，作者通過一系列的實(shí)驗(yàn)檢測缺氧誘導(dǎo)的ALKBH5是否影響CMECs血管生成。首先在常氧和低氧的CMECs模型中建立ALKBH5過表達(dá)模型（Figure 2A）。m6A斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)顯示，在缺氧和常氧條件下，ALKBH5過表達(dá)后m6A豐度降低（Figure 2B）。此外，ALKBH5的過表達(dá)降低了缺氧條件下的CMECs增殖（Figure 2C-E）、遷移和侵襲（Figure 2F-I）及血管生成能力（Figure2J-K），但是對常氧條件下的細(xì)胞無影響。綜上，ALKBH5的上調(diào)嚴(yán)重加劇了缺氧條件下的CMECs功能障礙，從而導(dǎo)致血管生成受損。
三、ALKBH5敲低降低了CMECs缺氧誘導(dǎo)的功能障礙
首先，在常氧和缺氧條件下，建立ALKBH5敲低模型（Figure 3A）。m6A斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，常氧和缺氧條件下，ALKBH5的敲低顯著均提升了整體m6A水平（Figures 3B）。但是，僅在缺氧條件下增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖（Figures 3C-E）、遷移和侵襲（Figures 3F-I）以及血管形成能力（Figures 3J-K）。在常氧條件下，ALKBH5的敲低不影響上述細(xì)胞功能。綜上，ALKBH5的敲低在防止缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮血管生成損傷方面起著關(guān)鍵作用。
四、MeRIP-seq與RNA-seq聯(lián)合發(fā)現(xiàn)了ALKBH5潛在的靶基因
以上結(jié)果已經(jīng)表明，ALKBH5與缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮血管生成密切相關(guān)，對ALKBH5敲降后，通過MeRIP-seq與RNA-seq方法進(jìn)行檢測，MeRIPseq共發(fā)現(xiàn)12783個(gè)共有峰，對照組477個(gè)獨(dú)特峰，ALKBH5敲降CMECs中2358個(gè)獨(dú)特峰。此外，發(fā)現(xiàn)了771個(gè)低甲基化峰和1072個(gè)高甲基化峰（Figure 4A），MeRIP-seq進(jìn)一步揭示了峰的分布特征（Figure 4B）和差異甲基化mRNA峰值的百分比（Figure 4C）。基于這些數(shù)據(jù)，對兩個(gè)CMECs組進(jìn)行了具有代表性的motif分析(Figure 4D)。富集基因差異表達(dá)分析顯示，1352個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，2914個(gè)基因表達(dá)上調(diào)(Figure 4E)，C型利鈉肽和FBXW5分別為低甲基化和高甲基化的代表(Figure 4F)。對這些基因進(jìn)行了GO分析，發(fā)現(xiàn)低甲基化轉(zhuǎn)錄本的富集主要參與細(xì)胞周期和RNA代謝等過程，而高甲基化轉(zhuǎn)錄本主要富集于血管新生和細(xì)胞增殖調(diào)控(Figure 4G)。POSTAR、血管生成數(shù)據(jù)庫、MeRIP-seq 數(shù)據(jù)和RNA-seq 數(shù)據(jù)得到，ALKBH5的靶基因能調(diào)節(jié)血管生成。從中選出的SKP2、WNT5A、FGF18可能是ALKBH5促血管生成的靶基因（Figure 4H），故后續(xù)對它們進(jìn)行進(jìn)一步研究。
五、ALKBH5調(diào)控WNT5A mRNA的穩(wěn)定性和衰減情況
MeRIP-seq數(shù)據(jù)顯示，敲除ALKBH5后，SKP2、WNT5A和FGF18的m6A豐度顯著增加（Figure 5A-B），RT-qPCR和Western blot分析得到，沉默ALKBH5，WB和QPCR的實(shí)驗(yàn)表明，WNT5A表達(dá)增高，但SKP2和FGF18表達(dá)變化不明顯（Figure 5C-D），故后續(xù)選擇WNT5A來進(jìn)行研究。因?yàn)?/span>mRNA m6A的內(nèi)部修飾對靶基因存在mRNA的穩(wěn)定性和衰減存在影響，所以采用放線菌素D來檢測WNT5A mRNA的穩(wěn)定性和衰減情況，添加放線菌素D之后，WNT5A表達(dá)呈時(shí)間依賴性降低，敲除 ALKBH5能顯著延遲WNT5A mRNA的降解，從而延長了其半衰期（Figure 5E）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ALKBH5過表達(dá)顯著降低了WNT5A的蛋白和mRNA表達(dá)水平、縮短了WNT5A mRNA的半衰期并降低了其穩(wěn)定性（Figure 5F-H）。而且，通過一系列細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WNT5A激動(dòng)劑可以顯著逆轉(zhuǎn)過表達(dá)ALKBH5對CMECs增殖、遷移、血管形成的抑制作用（Figure 5I-L）。
以上結(jié)果得到，ALKBH5通過去除轉(zhuǎn)錄后的m6A修飾，促進(jìn)WNT5A mRNA的衰變，降低其半衰期，從而影響缺氧條件下CMECs的生物學(xué)功能。
六、ALKBH5過表達(dá)減弱小鼠后肢缺血造成的小鼠缺血損傷后的血流恢復(fù)和血管生成作用
作者建立了小鼠后肢缺血模型，然后檢測ALKBH5在模型中一段時(shí)間的表達(dá)情況。結(jié)果所示，ALKBH5隨著時(shí)間的推移呈動(dòng)態(tài)變化，在6小時(shí)以內(nèi)，呈增高趨勢，缺血后1-21天時(shí)，呈降低趨勢，到28天時(shí)，ALKBH5的表達(dá)已回復(fù)至缺血前。為了研究ALKBH5在體內(nèi)對缺血血管生成的影響，在小鼠后肢缺血前4周，通過AAV注射小鼠腓腸肌，使ALKBH5持續(xù)過表達(dá)（Figure 6A）。數(shù)據(jù)顯示，ALKBH5 mRNA和ALKBH5蛋白顯著上調(diào)（補(bǔ)充數(shù)據(jù)加Figure 6B），在過表達(dá)ALKBH5的情況下，m6A豐度顯著降低（Figure 6C），通過激光多普勒超聲掃描系統(tǒng)后肢缺血后的血流恢復(fù)情況發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，過表達(dá)ALKBH5
湘公網(wǎng)安備
