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        大家好！本期普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是SNP/單核苷酸多態(tài)性檢測最常用的幾種方法，SNP常用檢測方法總結(jié)由普拉特澤生物表達(dá)檢測平臺總結(jié)分享。SNP檢測服務(wù)是檢測染色體基因組中單個核苷酸的突變而引起的DNA序列的多態(tài)性的技術(shù)服務(wù)，作為表達(dá)檢測平臺的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，我們積累了大量的實(shí)操經(jīng)驗(yàn)與案例，無論是SNP檢測外包還是技術(shù)咨詢，我們都會給到最專業(yè)的回復(fù)，現(xiàn)在我們就來看看我們表達(dá)檢測平臺最常用的三種檢測SNP方法吧！

        1、Taqman探針法(定性)

        針對染色體上的不同SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)PCR引物和TaqMan探針，進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增。探針的5’-端和3’-端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)溶液中存在PCR產(chǎn)物時，該探針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’-端連接的熒光分子從探針上切割下來，破壞兩熒光分子間的PRET，發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點(diǎn)分析。

        高分辨率熔解曲線分析（HRM）是近幾年興起的SNP研究工具，它通過實(shí)時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，來判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點(diǎn)、是否是雜合子等都會影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。這種檢測方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解，即可完成對樣品基因型的分析。該方法無需設(shè)計(jì)探針，操作簡便、快速，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。

   2、直接測序法

        Sanger測序是DNA序列分析的經(jīng)典方法，可直接獲取核酸序列信息，是SNP檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。而且，Sanger測序可發(fā)現(xiàn)未知的 SNP位點(diǎn)，確定SNP 的突變類型和突變位置，是一種無法替代的最直接、最準(zhǔn)確的SNP檢測方法。

        采用測序法檢測SNP時，首先可將含有SNP位點(diǎn)的靶標(biāo)序列通過PCR擴(kuò)增形成DNA片段后，再利用Sanger測序獲取目標(biāo)區(qū)域的核酸序列，并對SNP位點(diǎn)進(jìn)行比對，由此即可確定是否存在變異位點(diǎn)。

        Sanger測序是基于雙脫氧核糖核苷酸（ddNTP）末端終止的方法進(jìn)行檢測的。即在四個單獨(dú)的反應(yīng)體系中，分別對應(yīng)摻入四種帶有不同顏色標(biāo)記的A、T、G、C雙脫氧核苷酸，使得核苷酸在某一固定點(diǎn)開始延伸反應(yīng)，而延伸過程中若摻入ddNTP，則由于堿基上無3’-OH導(dǎo)致延伸無法繼續(xù)，從而隨機(jī)在某一特定堿基處終止，形成相差一個堿基的不同系列長度的核酸片段，再利用毛細(xì)管電泳分離這些不同長度的核酸片段，最后通過不同堿基標(biāo)記的顏色讀取待測核酸的堿基序列，由此獲得目標(biāo)區(qū)域的核苷酸序列。

        3、ARMS-PCR法

        擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR），又稱為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR, AS-PCR），是基于Taq DNA 聚合酶無法修復(fù)引物3’末端的單個堿基錯配，從而使得擴(kuò)增受阻的檢測方法。在擴(kuò)增過程中，只有當(dāng)引物3’末端的堿基與SNP位點(diǎn)的等位基因互補(bǔ)配對時，才能正常延伸擴(kuò)增；而當(dāng)引物3’末端的堿基與SNP位點(diǎn)的等位基因不互補(bǔ)配對時，則不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，由此對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳或熒光PCR檢測，則可確定SNP基因型。

        ARMS-PCR法的熒光PCR檢測時，同樣使用TaqMan探針，只是將SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物3’末端，因此理論上只有引物3’端與模板完全匹配時，才能形成擴(kuò)增曲線；但在實(shí)際檢測時，單個堿基的錯配依然可以延伸擴(kuò)增，只是效率較低。為了提高其特異性，有時需在靠近引物3’末端的位置人為引入錯配堿基，以降低非靶標(biāo)序列的擴(kuò)增效率。

        實(shí)際操作中，我們最常用的三種檢測SNP的方法就是：Taqman探針法、直接測序法和ARMS-PCR法，當(dāng)然檢測SNP有很多的方法，如果您準(zhǔn)備學(xué)習(xí)SNP檢測或有SNP檢測外包代做的需求歡迎給客服留言，技術(shù)會技術(shù)聯(lián)系回復(fù)您，那我們下篇一起學(xué)習(xí)SNP檢測的另外幾種檢測方法~咱們下期見！