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  細胞增殖是活細胞的重要生理功能之一，是生物體的重要生命特征，是生物體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎，是腫瘤研究的重要表型之一，同時也是分子生物學和藥理學研究解決問題的關鍵。通過在細胞中過表達或干擾某個基因研究基因?qū)毎鲋衬芰Φ挠绊?，進一步研究基因的功能，或?qū)毎M行藥物處理，研究藥物對增殖的影響。

細胞增殖檢測通常是基于DNA含量或細胞代謝實現(xiàn)的，主要為對活細胞的代謝活性的檢測(基于WST、MTS、XTT、MTT等)及對DNA合成的檢測(基于BrdU的免疫法或EdU的點擊化學法)；同時也可通過體內(nèi)成像、微孔板或流式細胞術檢測等多種技術進行細胞追蹤。

那么我們使用藥物時評估毒性、篩選抗腫瘤、判斷細胞增殖速度或者探究某些基因蛋白的功能時，就可以通過細胞增殖來反映。今天主要給大家介紹活細胞代謝檢測中應用的比較廣泛的MTT、MTS和CCK8這三類方法。

一、細胞增殖檢測的原理

1、MTT法

活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。

2、MTS法

原理與MTT相近，屬于在MTT基礎上的改良，含有一個新型的四唑化合物和一種電子偶聯(lián)劑（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ　ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ，PES），PES具有增強的化學穩(wěn)定性，這使它可與MTS混合形成穩(wěn)定的溶液。MTS被細胞生物還原成為一種有色的甲臜產(chǎn)物，可直接溶解于培養(yǎng)基中。這種轉(zhuǎn)化是在代謝活躍的細胞中的脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH的作用下完成的。避光孵育3h后，在492nm處有一個最大的吸收峰，檢測到的甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)中的活細胞數(shù)成正比。

3、CCK8法

在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy?PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物。生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。

二、細胞增殖檢測常用技術的聯(lián)系與區(qū)別

為了讓大家更直觀的了解到這三種檢測方法的聯(lián)系與區(qū)別，我們采用了列表的方法：

三、細胞增殖檢測的實驗操作步驟

1、細胞培養(yǎng)：觀察細胞的增長特性（細胞形態(tài)、增長速度等）

2、鋪板：鋪板密度建議5*103~10*103/孔，在操作臺靜置10分鐘，有利于細胞的自由沉降，鋪板更加均勻

3、培養(yǎng)細胞：將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱中，至細胞貼壁且狀態(tài)穩(wěn)定

4、藥物處理：棄培養(yǎng)基，更換含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)（注意要過濾之后再使用，且要現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復凍融）

5、MTT呈色:避光加1/10體積MTT溶液(5 mg/mL)，37℃孵育4 h，孵育完成后除盡孔內(nèi)上清液，每孔加150 uL DMSO，振蕩10 min;

或MTS呈色:避光加1/10體積MTS溶液，37℃孵育3h;

或CCK8呈色:避光加1/10體積CCK-8溶液，孵育37℃1-4h;

6、上機檢測OD490nm/492 nm/450 nm值

四、細胞增殖培養(yǎng)的實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

這三種方法最后的結(jié)果是以細胞相對存活率或IC₅₀這兩個指標呈現(xiàn)：

1、細胞相對存活率%=(處理組OD值-調(diào)零孔OD值)/(對照組OD值-調(diào)零孔OD值)*100

2、IC5計算：指某一藥物或者物質(zhì)(抑制劑)在抑制某些生物程序(如酶、細胞受體、是微生物)的半量，即50%抑制濃度

五、細胞增殖檢測的注意事項

當您根據(jù)具體的實驗情況選擇了合適的檢測方法的時候，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果還是不理想，問題出在哪呢？

我們?yōu)槟砹艘韵聦嶒灢僮髯⒁馐马?，希望能對您有所幫助?/span>

1 、鋪板

細胞數(shù)量：在前期細胞培養(yǎng)中，觀察細胞貼壁率、貼壁后面積大小、倍增時間，以確保處理過程中不會細胞過滿（鋪板太密或長太久，細胞都會擠死掉的?。?，準確呈現(xiàn)處理因素與細胞數(shù)的關系（5×103 ~10×103 ）。意思就是先了解下你需要檢測的細胞，做個預實驗先。

2、避免血清的干擾

用含胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞時，高濃度血清物質(zhì)（我也會吸光噠！）會影響試驗孔的吸光度值，降低實驗敏感度。

3、防止邊緣效應及復孔設置

應在96孔板邊緣滴加PBS，邊緣孔的水分揮發(fā)較快，藥物易被濃縮，對實驗影響很大大。復孔，做3-5個，推薦5個（別省那點板子?。。?。

細胞增殖與活性檢測你弄混了嗎點此跳轉(zhuǎn)

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