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WB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和詳細(xì)的操作步驟由普拉特澤生物表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為大家總結(jié)分享。普拉特澤生物為廣大科研人員提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的Western blot外包實(shí)驗(yàn)服務(wù)，本文給大家分享咱們技術(shù)長(zhǎng)期總結(jié)下來的wb實(shí)驗(yàn)報(bào)告和詳細(xì)的操作步驟

一、Western blot實(shí)驗(yàn)原理

蛋白免疫印跡 (Western Blot) 采用的是聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE) 電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的特異性抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。

二、實(shí)驗(yàn)通用儀器及試劑

2.1 主要儀器

2.2 主要試劑

三、實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 蛋白提取

(1)樣本的收集：

細(xì)胞：用1 mL生理鹽水對(duì)離心下來的細(xì)胞進(jìn)行洗滌，同時(shí)將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中。

組織：取適量組織剪碎，研磨勻漿。

(2)按1 mL裂解液加10 μL PMSF (100 mM)，搖勻置于冰上。PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。

(3)根據(jù)細(xì)胞量的多少，每管細(xì)胞加100-500 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。

(4)4℃下12000 rpm離心10 min。離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，用于蛋白定量檢測(cè)。若不能及時(shí)定量蛋白濃度，請(qǐng)置于-80℃保存。

3.2 蛋白定量及處理（BCA法）

(1)使用時(shí)將BCA試劑盒中 Solution A搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積Solution A加1體積Solution B (50:1) 配置適量BCA工作液，充分混勻后即成淡綠色的工作液。BCA工作液室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

(2)將標(biāo)準(zhǔn)品 (1mg/mL BSA) 按0、1、2、4、6、8、10 μL的量分別加入96孔板中，再加入去離子水將所有標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)足到10 μL。

(3)加1 μL的樣品到96孔板中，加去離子水補(bǔ)足到10 μL。

(4)各孔加入200 μL BCA工作液，輕輕用移液器吹打混勻（注意不要產(chǎn)生氣泡以免影響讀數(shù)），37℃孵育30 min。

(5)冷卻到室溫后，用酶標(biāo)儀測(cè)定A562的吸光度值。

(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。

(7)蛋白變性處理：蛋白溶液與5×Loading buffer 按照體積比4：1混勻（此時(shí)蛋白濃度變成實(shí)際檢測(cè)濃度的0.8倍），置于沸水中煮10min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，或儲(chǔ)存于-80℃，避免反復(fù)凍融。

(8)蛋白濃度的計(jì)算公式

舉例標(biāo)曲為：Y=aX+b（Y為OD值，X為測(cè)定濃度）

樣品蛋白濃度=[（Y-b）/a]×稀釋倍數(shù)

3.3 Western Blot

(1)配制分離膠和濃縮膠：根據(jù)目的蛋白分子量大小，配分離膠和5%濃縮膠。

(2)上樣：計(jì)算含20~80 μg蛋白的溶液體積，即為上樣量。用1×Loading buffer 補(bǔ)至每個(gè)加樣孔的總體積一致。

(3)電泳：濃縮膠電壓為80 V，40 min，分離膠電壓120 V，30-50 min。溴酚藍(lán)跑至膠底即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。

(4)轉(zhuǎn)膜：恒壓100V，0.45/0.22 μm PVDF膜。

(5)封閉： 將PVDF膜完全浸沒在5% milk-PBST或5% BSA-PBST中，室溫輕搖60 min或4℃過夜。

(6)一抗孵育：用5% BSA-PBST稀釋一抗，4℃孵育過夜。

(7)洗膜：次日取出PVDF膜，PBST洗膜5次，每次6 min。

(8)二抗孵育：PBST稀釋二抗，室溫孵育60 min。

(9)洗膜：PBST洗膜5次，每次6 min。

(10)顯影：ECL A和B液按體積1:1混合后均勻滴加在膜上，按需求設(shè)置曝光時(shí)間及曝光類型，開始曝光，曝光結(jié)束后保存圖片并導(dǎo)出圖片。

3.4 圖像分析

用圖像分析軟件Image J對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

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