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 熒光原位雜交操作步驟由普拉特澤生物總結(jié)分享，上期我們分享了RNA原位雜交的詳細(xì)操作步驟，感興趣的同學(xué)可以回去復(fù)習(xí)哦。普拉特澤生物實(shí)驗(yàn)室專業(yè)承接熒光原位雜交等組織檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，經(jīng)驗(yàn)豐富，質(zhì)量可靠，那現(xiàn)在我們就來看看以某組織樣本為例，F(xiàn)ISH檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)原理與詳細(xì)步驟吧！

        熒光原位雜交技（FISH）原理：是利用熒光標(biāo)記的特異核酸探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號(hào)，來確定與特異探針雜交后被染色的細(xì)胞或細(xì)胞器的形態(tài)和分布，或者是結(jié)合了熒光探針的DNA區(qū)域或RNA分子在染色體或其他細(xì)胞器中的定位。

熒光原位雜交技（FISH）實(shí)驗(yàn)步驟：

1.切片脫蠟水化。

2.通透
a.【1XPBS】清洗5 min；b.加入預(yù)冷的【通透液】（含0.5%TritonX-100的PBS），4°C靜置5 min；c.棄去【通透液】后，加入【1XPBS】清洗5 min，3次。

3.探針檢測(cè)

a.加入200 uL【預(yù)雜交液】，37°C封閉30 min；（預(yù)雜交液：將適量BlockingSolution與Pre-hybridizationBuffer按
照1：99混勻后，37℃孵育至透明澄清狀態(tài)（約30 min）后，分裝保存。在使用前，須在37℃氣浴或水浴中孵育至澄清透明。）b.預(yù)雜交同時(shí)，將【雜交液】在37°C中預(yù)熱；c.避光條件下，把2.5uL探針加入到100μl【雜交液】中；注：探針濃度可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行優(yōu)化。雜交液配制：將適量BlockingSolution與HybridizationBuffer按照1：99混勻，37℃孵育30min后分裝保存。在使用前，須先在37℃氣浴或水浴中孵育30 min。雜交液顏色偏黃屬于正常現(xiàn)象注：PrehybridizationBuffer（試劑A）和HybridizationBuffer（試劑B）從低溫取出時(shí)可能有沉淀析出，屬于正常現(xiàn)象。

d.棄去切片中的【預(yù)雜交液】，加入100uL含有探針的【探針雜交液】，避光，37°C雜交過夜。e.避光，42°C，【雜交洗液I】清洗3次，每次5 min，以降低背景信號(hào)；f.避光，42°C，【雜交洗液II】清洗1次；g.避光，42°C，【雜交洗液III】清洗1次；h.避光，【1XPBS】清洗，室溫5min。注：所有指定溫度的步驟，注意將相關(guān)試劑預(yù)熱到對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)所需溫度后再使用。

4.DNA染色a.避光，【1XDAPI染色液】染色10 min，染色液用量以覆蓋待雜交區(qū)域所有細(xì)胞為宜；b.避光，【1XPBS】清洗3次，每次5 min。(如組織有自發(fā)熒光，可增加步驟蘇丹黑自發(fā)熒光淬滅劑進(jìn)行淬滅。）

5.封片避光條件下，滴加封片劑用蓋玻片密封，進(jìn)行熒光檢測(cè)。

        好啦，那關(guān)于熒光原位雜交詳細(xì)的操作步驟到這里就結(jié)束啦，供大家學(xué)習(xí)參考。和RNA原位雜交一樣，新手如果準(zhǔn)備上手操作的話不建議操作照搬哦，不同的實(shí)驗(yàn)樣本實(shí)驗(yàn)方案或許會(huì)有相應(yīng)的調(diào)整，需要技術(shù)咨詢的同學(xué)歡迎給客服留言，技術(shù)會(huì)一一詳細(xì)解答，更有原位雜交外包需求的同學(xué)，普拉特澤隨時(shí)為您服務(wù)哦！