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免疫熒光常見問題與處理方法由普拉特澤生物——病理實(shí)驗(yàn)平臺(tái)總結(jié)分享，文末附上免疫熒光實(shí)操視頻供大家學(xué)習(xí)。本文根據(jù)我們承接的各類樣本免疫熒光實(shí)驗(yàn)與技術(shù)咨詢總結(jié)而來，歡迎大家補(bǔ)充完善。

免疫熒光-普拉特澤生物

免疫熒光常見問題一：目標(biāo)蛋白的熒光很弱，導(dǎo)致組間差異并不明顯，造成假陰性結(jié)果

這種情況出現(xiàn)后，首先要檢查一下抗體對(duì)不對(duì)，是否適用于你的預(yù)處理組織。有些抗體只適用于冰凍切片，但若將其應(yīng)用于石蠟切片，就會(huì)造成弱標(biāo)記或無標(biāo)記現(xiàn)象，然后通過文獻(xiàn)等查找一下目標(biāo)蛋白在該組織或細(xì)胞的表達(dá)豐度如何。此外，如果抗體修復(fù)不充分，抗原表位未完全暴露，也會(huì)出現(xiàn)弱標(biāo)記現(xiàn)象。比如，盡管大多數(shù)抗體都是在酸性環(huán)境中修復(fù)，但是也存在少量的抗體需要在堿性環(huán)境中修復(fù)，建議查看抗體說明書，嚴(yán)格按照其修復(fù)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

免疫熒光常見問題二：目標(biāo)蛋白的熒光太強(qiáng)，甚至形成非特異性的標(biāo)記，一些背景染色可能被誤認(rèn)為陽性區(qū)域，造成假陽性結(jié)果

這種情況一般出現(xiàn)在抗體濃度過高而漂洗又不充分的時(shí)候。多余的抗體會(huì)吸附在組織上，造成熒光圖像整體高背景。

解決方法是適當(dāng)降低一抗或者二抗的濃度，增加漂洗時(shí)間，一般能夠有所改善。

免疫熒光常見問題三：DAPI染細(xì)胞核時(shí)，加入的試劑太多，造成高背景染色

防熒光衰減的DAPI試劑，使用時(shí)滴上一滴就能將細(xì)胞核標(biāo)記，但滴加的量太多時(shí)，會(huì)造成整張圖像呈現(xiàn)出藍(lán)色的背景。因此，滴加的DAPI不要太多，只需覆蓋上薄薄的一層即可。

免疫熒光常見問題四：組織切片預(yù)處理不當(dāng)或采用石蠟切片，導(dǎo)致高背景染色

如果組織切片，尤其是石蠟切片脫蠟環(huán)節(jié)不徹底，也會(huì)造成區(qū)域性的非特異性標(biāo)記。建議脫蠟一定要徹底，脫蠟前充分烤片也可以幫助脫蠟。

實(shí)驗(yàn)過程中，玻片干燥了，同樣會(huì)造成高背景或大面積的非特異性標(biāo)記。漂洗環(huán)節(jié)和抗體孵育環(huán)節(jié)最容易出現(xiàn)干片現(xiàn)象，尤其是大批量實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要注意。使用免疫組化專用筆畫個(gè)圈，可以有效改善。

免疫熒光常見問題五：采集圖像過程不當(dāng)，導(dǎo)致原始圖像不佳，直接影響后續(xù)半定量分析

采集圖像時(shí)不要對(duì)每一張圖像都加上標(biāo)尺，否則后期采用Image J或者IPP進(jìn)行分析時(shí)，這些標(biāo)尺會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。采集圖像時(shí)，速度要快。如果激發(fā)光很長(zhǎng)時(shí)間對(duì)準(zhǔn)目標(biāo)區(qū)域，此區(qū)域內(nèi)的熒光衰減會(huì)極快，有經(jīng)驗(yàn)的人都知道，不必多說。因此，目標(biāo)區(qū)域較小時(shí)，一定要盡量快速采集，減少人為實(shí)驗(yàn)誤差。

以上就是我們總結(jié)的關(guān)于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的常見問題及其處理的方法，免疫熒光視頻請(qǐng)點(diǎn)擊《免疫熒光/IF染色理論+實(shí)操》，有免疫熒代做需求的老師可直接留言，我們會(huì)馬上與您取得聯(lián)系~

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