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大家好！本期普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是SNP/單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)最常用的幾種方法，SNP常用檢測(cè)方法總結(jié)由普拉特澤生物表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)總結(jié)分享。SNP檢測(cè)服務(wù)是檢測(cè)染色體基因組中單個(gè)核苷酸的突變而引起的DNA序列的多態(tài)性的技術(shù)服務(wù)，作為表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，我們積累了大量的實(shí)操經(jīng)驗(yàn)與案例，無論是SNP檢測(cè)外包還是技術(shù)咨詢，我們都會(huì)給到最專業(yè)的回復(fù)，現(xiàn)在我們就來看看我們表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)最常用的三種檢測(cè)SNP方法吧！

1、Taqman探針法(定性)

針對(duì)染色體上的不同SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)PCR引物和TaqMan探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。探針的5’-端和3’-端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)溶液中存在PCR產(chǎn)物時(shí)，該探針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’-端連接的熒光分子從探針上切割下來，破壞兩熒光分子間的PRET，發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點(diǎn)分析。

高分辨率熔解曲線分析（HRM）是近幾年興起的SNP研究工具，它通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，來判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點(diǎn)、是否是雜合子等都會(huì)影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。這種檢測(cè)方法不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨率熔解，即可完成對(duì)樣品基因型的分析。該方法無需設(shè)計(jì)探針，操作簡(jiǎn)便、快速，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。

2、直接測(cè)序法

Sanger測(cè)序是DNA序列分析的經(jīng)典方法，可直接獲取核酸序列信息，是SNP檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。而且，Sanger測(cè)序可發(fā)現(xiàn)未知的 SNP位點(diǎn)，確定SNP 的突變類型和突變位置，是一種無法替代的最直接、最準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法。

采用測(cè)序法檢測(cè)SNP時(shí)，首先可將含有SNP位點(diǎn)的靶標(biāo)序列通過PCR擴(kuò)增形成DNA片段后，再利用Sanger測(cè)序獲取目標(biāo)區(qū)域的核酸序列，并對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，由此即可確定是否存在變異位點(diǎn)。

Sanger測(cè)序是基于雙脫氧核糖核苷酸（ddNTP）末端終止的方法進(jìn)行檢測(cè)的。即在四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)體系中，分別對(duì)應(yīng)摻入四種帶有不同顏色標(biāo)記的A、T、G、C雙脫氧核苷酸，使得核苷酸在某一固定點(diǎn)開始延伸反應(yīng)，而延伸過程中若摻入ddNTP，則由于堿基上無3’-OH導(dǎo)致延伸無法繼續(xù)，從而隨機(jī)在某一特定堿基處終止，形成相差一個(gè)堿基的不同系列長(zhǎng)度的核酸片段，再利用毛細(xì)管電泳分離這些不同長(zhǎng)度的核酸片段，最后通過不同堿基標(biāo)記的顏色讀取待測(cè)核酸的堿基序列，由此獲得目標(biāo)區(qū)域的核苷酸序列。

3、ARMS-PCR法

擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR），又稱為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR, AS-PCR），是基于Taq DNA 聚合酶無法修復(fù)引物3’末端的單個(gè)堿基錯(cuò)配，從而使得擴(kuò)增受阻的檢測(cè)方法。在擴(kuò)增過程中，只有當(dāng)引物3’末端的堿基與SNP位點(diǎn)的等位基因互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，才能正常延伸擴(kuò)增；而當(dāng)引物3’末端的堿基與SNP位點(diǎn)的等位基因不互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，則不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，由此對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳或熒光PCR檢測(cè)，則可確定SNP基因型。

ARMS-PCR法的熒光PCR檢測(cè)時(shí)，同樣使用TaqMan探針，只是將SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物3’末端，因此理論上只有引物3’端與模板完全匹配時(shí)，才能形成擴(kuò)增曲線；但在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，單個(gè)堿基的錯(cuò)配依然可以延伸擴(kuò)增，只是效率較低。為了提高其特異性，有時(shí)需在靠近引物3’末端的位置人為引入錯(cuò)配堿基，以降低非靶標(biāo)序列的擴(kuò)增效率。

實(shí)際操作中，我們最常用的三種檢測(cè)SNP的方法就是：Taqman探針法、直接測(cè)序法和ARMS-PCR法，當(dāng)然檢測(cè)SNP有很多的方法，如果您準(zhǔn)備學(xué)習(xí)SNP檢測(cè)或有SNP檢測(cè)外包代做的需求歡迎給客服留言，技術(shù)會(huì)技術(shù)聯(lián)系回復(fù)您，那我們下篇一起學(xué)習(xí)SNP檢測(cè)的另外幾種檢測(cè)方法~咱們下期見！

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