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        MTT法檢測細(xì)胞增殖由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享，文末附上細(xì)胞常見實(shí)驗(yàn)理論+實(shí)操視頻教程，供大家觀看學(xué)習(xí)。普拉特澤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺專業(yè)提供細(xì)胞增殖檢測外包服務(wù)，積累了大量的細(xì)胞增殖檢測的經(jīng)驗(yàn)與案例，今天就跟大家分享一下MTT法檢測細(xì)胞增殖的原理與步驟。

        首先是MTT法檢測細(xì)胞增殖的原理：

        MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的甲瓚結(jié)晶，甲瓚結(jié)晶的生成量僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比。還原生成的甲瓚結(jié)晶可以用DMSO來溶解，利用酶標(biāo)儀測定570 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。

        其次就是MTT檢測細(xì)胞增殖的詳細(xì)步驟：

        1.接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000－10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul.

        2.培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)2-3天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。

        3.顯色：分別培養(yǎng)不同時(shí)間，每孔加MTT溶液（5mg/mL用PBS 配)20ul.繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150uL DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。

        4.比色：選擇570nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

        結(jié)果：以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線或計(jì)算細(xì)胞生長抑制率、細(xì)胞相對增殖率等。

        最后就是MTT法檢測細(xì)胞增殖的注意事項(xiàng)：

        1、培養(yǎng)好目的細(xì)胞

        將目的細(xì)胞培養(yǎng)好是一切細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。如果不知道如何培養(yǎng)細(xì)胞，可查看相關(guān)的文獻(xiàn)，不同細(xì)胞有各自的不同特點(diǎn)，可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)要求及培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)適當(dāng)調(diào)整。培養(yǎng)細(xì)胞的過程中，注意無菌操作，切記引起細(xì)胞污染。

        2、細(xì)胞鋪板

        將細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后，大概了解細(xì)胞的增殖情況。根據(jù)細(xì)胞的生長情況反推鋪板時(shí)的細(xì)胞濃度。將消化后的細(xì)胞反復(fù)吹打，充分混勻盡量使細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)再鋪板。此時(shí)，注意不要過分依賴細(xì)胞計(jì)數(shù)，因?yàn)榧?xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，取樣量較多（10mL），存在細(xì)胞顆粒的不均勻分布會直接影響后期實(shí)驗(yàn)，故掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)，但細(xì)胞鋪板時(shí)不能完全依賴它。選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。

        3、避免血清干擾

        一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

        4、設(shè)空白對照

        與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，

        最后比色以空白調(diào)零。

        5、加MTT

        如果待檢測藥物有氧化還原性，則加MTT前換一次液或用PBS將細(xì)胞清洗一遍，防止待測藥物將MTT還原成棕褐色沉淀，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。注意，加入MTT溶液時(shí)，在避光條件下進(jìn)行。

        6、MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系。

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