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大家好，今天普拉特澤生物繼續(xù)給大家介紹一個新的實驗——支原體檢測實驗。支原體是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，極易感染實驗室中的實驗細(xì)胞，相信每一個親手養(yǎng)過細(xì)胞的實驗員都對這種又小又無處不在的原核生物深惡痛絕，一個不小心，培養(yǎng)基細(xì)胞團(tuán)滅還摸不出原因。普拉特澤表達(dá)檢測平臺為廣大科研服務(wù)人員提供專業(yè)的支原體檢測外包服務(wù)，歡迎咨詢。

那現(xiàn)在我們先來看看，什么是支原體吧~

支原體（mycoplasma）是一類沒有細(xì)胞壁、高度多形性、能通過濾菌器、可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細(xì)胞型微生物，大小為0.1～0.3微米。由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。支原體廣泛存在于人和動物體內(nèi)，大多對動物不致病，但是對人致病的支原體。

支原體的革蘭染色為陰性，但不易著色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。支原體主要以二分裂方式繁殖，亦可以出芽方式繁殖，分枝形成絲狀后斷裂呈球桿狀顆粒。大部分支原體繁殖速度比細(xì)菌慢，適宜生長溫度為35℃，最適pH值為7.8～8.0。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成典型的“荷包蛋”狀菌落。支原體抵抗力較弱，對熱、干燥敏感，對75%乙醇、煤酚皂溶液敏感，對紅霉素、四環(huán)素、螺旋霉素、鏈霉素、卡那霉素等藥物敏感，但對青霉素類的抗生素不敏感。臨床上支原體致病性較弱，一般不侵入血液，但可通過黏附作用與宿主細(xì)胞結(jié)合，從細(xì)胞膜獲取脂質(zhì)，使細(xì)胞膜損傷。溶脲脲原體可分解尿素放出大量的氨，對細(xì)胞有毒害。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，由于實驗環(huán)境、操作者鼻腔口腔、實驗器材等很多地方都有支原體的存在。因此，細(xì)胞發(fā)生支原體污染的頻率很高。同時，由于支原體直徑很小，僅在0.1～0.3微米之間，只有通過電鏡才能看到。因此，支原體污染不易被實驗者肉眼發(fā)覺。而支原體污染是個循序的過程，普通抗生素對其無效。因此，被支原體污染的細(xì)胞會持續(xù)受到影響，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。

支原體檢測試驗的原理是根據(jù)特定序列設(shè)計引物PCR擴(kuò)增后用瓊脂糖電泳檢測是否能跑出條帶：

原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列差別很大。這個間隔區(qū)的DNA序列及長度在Mycoplasma 各個種間既有相對保守的部分，也有具有很大差異的部分。本制品是在編碼16S 和23SrRNA的DNA 上設(shè)計一對F1/R1 引物，擴(kuò)增編碼16S 和23S rRNA 的DNA 間隔區(qū)。此反應(yīng)體系只特異性擴(kuò)增Mycoplasma DNA，檢出靈敏度與特異性都很高。

通過對支原體特定的序列設(shè)計引物，當(dāng)存在支原體污染時通過PCR特異性擴(kuò)增，會將目標(biāo)DNA特異性地復(fù)制，然后通過瓊脂糖電泳檢測，會跑出條帶出現(xiàn)陽性結(jié)果。反之當(dāng)沒有支原體污染時，由于沒有模板，PCR無法擴(kuò)增，則瓊脂糖電泳跑不出條帶，出現(xiàn)陰性結(jié)果。

同時在取細(xì)胞樣本進(jìn)行支原體檢測時要注意：

1、取待檢樣本：

一般是接種后進(jìn)行 3-6d細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液；

如果使用 Eagle 等常用的細(xì)胞培養(yǎng)基時，培養(yǎng)上清可直接加入到 PCR 反應(yīng)液中；

如果使用細(xì)胞懸濁液作為樣品，則需要提取 DNA，再進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。

2、一定要設(shè)置陽性對照（一般采用帶有支原體特異片段的質(zhì)粒）與陰性對照（H2O）；

3、配制PCR反應(yīng)體系時需在超凈工作臺里進(jìn)行，避免污染。

希望大家在培養(yǎng)細(xì)胞時永遠(yuǎn)不會在自己的培養(yǎng)基檢測到支原體這種小小的原核生物，如果您正好有細(xì)胞需要進(jìn)行支原體檢測外包的話普拉特澤生物義不容辭！后兩期支原體檢測的詳細(xì)操作步驟與細(xì)胞被支原體污染后的處理方法~下期見~

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