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實驗介紹
【鑒定方法】
基于SEC+超濾的外泌體分離方法，可方便快捷進行高純度及高回收率的外泌體分離。以熒光外泌體作為標準品，Exosupur可回收94.87%的熒光外泌體；能夠去除99.44%的血漿游離雜蛋白，如主要的miRNA結(jié)合蛋白Ago、血漿雜蛋白HAS在Exosupur中更少；跟超離及市面常見試劑盒相比，該方法提取的外泌體的particle數(shù)與蛋白含量比值更高，表明分離得外泌體純度更高，雜蛋白含量更低。
MISEV2018（細胞外囊泡雜志）對外泌體的表征規(guī)定了最小試驗要求：
① 總體表征：
至少3個陽性（至少包括1個跨膜蛋白和1個細胞溶質(zhì)蛋白）、1個陰性蛋白質(zhì)標志物。
② 個體表征：
電鏡或原子力顯微鏡、單顆粒追蹤兩種方法互為補充。
1、電鏡檢測
透射電子顯微鏡觀察法（TEM）是從形態(tài)和大小上對外泌體進行鑒定。通過負染的方法，在高倍放大下直接觀察單個外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小。
檢測儀器：透射電子顯微鏡（HITACHI，H-7650）
樣本要求：BCA濃度300-400ng/μl，體積10μl；避免反復凍融，4℃保存，冰袋運輸。
結(jié)果呈現(xiàn)：
2、粒徑檢測
粒徑分析是從整體上對外泌體大小的分布情況進行檢測，具有準確、快速、重復性好等優(yōu)點，是對現(xiàn)有外泌體鑒定方法的良好補充。
檢測儀器：Particle Metrix（ZetaView）
樣本要求： 避免反復凍融，4℃保存，冰袋運輸。
結(jié)果呈現(xiàn)：
樣本名稱 | 平均粒徑(nm) | 粒徑主峰(nm) | 主峰所占百分比(%) | 濃度 (Particles / mL) |
血漿 | 105.7 | 85.5 | 99.2 | 1.0E+8 |
3、Western Blot檢測
Western blot是通過抗原抗體特異性結(jié)合的原理，對外泌體標志蛋白進行檢測，從蛋白質(zhì)層面對外泌體進行鑒定。常用的外泌體標志蛋白包括CD63、TSG101及Alix等。
檢測方法：ECL化學發(fā)光，傳統(tǒng)膠片曝光或者專用曝光儀器。
樣本要求：血漿樣本BCA量60ug，＞0.5μg/μl；細胞上清BCA量40μg，＞0.5μg/μl；冰袋運輸。
結(jié)果呈現(xiàn)：
案例展示
技術(shù)總結(jié)
【常見問題】
1、血漿電鏡圖片為什么背景那么雜？
答：血漿中雜蛋白如糖蛋白、鐵蛋白，低密度脂蛋白等粒徑大小與外泌體非常接近，且
含量偏高，現(xiàn)有的分離方法無法完全剔除，所以會出現(xiàn)有一些雜蛋白背景。
2、CD63 條帶為什么呈彌散狀？這樣發(fā)文章能用嗎？
答：由于 CD63 的糖基化水平不同，導致其條帶呈彌散狀，這是蛋白本身的特點，所以不會
影響文章的發(fā)表。
送檢與交付標準
【送檢標準】
（一）、血漿樣本采集
1、請用EDTA抗凝管采集患者血液（a），若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過4 h）；
2、將采集到的血液在4℃下1500 g，離心20 min，去除血液中的細胞；
3、取上清，4℃下3000 g，離心15 min，收集上清（血漿），-80℃保存。
4、送樣量： 排阻+超濾 4mL（夠2次分離）
超離 4mL
注意事項：①請勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放；②請排除乙肝病毒，HIV等病毒感染樣本。
（二）、血清樣本采集
1、請用EDTA抗凝管采集患者血液（a），若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過4 h）；
2、將采集到的血液在4℃下1500 g，離心20 min，去除血液中的細胞；
3、取上清，4℃下13000 g，離心2 min，收集上清（血清），-80℃保存。
4、送樣量： 超離 4 mL
排阻+超濾 1mL
注意事項：請排除乙肝病毒，HIV等病毒感染樣本。
（三）、尿液樣本采集
1、采集前/中后段晨尿約60 mL，若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；
2、將采集到的尿液在4℃下（室溫亦可）離心2000 g，20 min，去除尿液中的細胞；-80℃保存；
3、送樣量：60 mL。
注意事項：請務(wù)必囑咐患者，①采集晨尿，或6 h以上未排尿亦可；②中段尿請務(wù)必去掉最初排出的50-80 mL尿液；③女性受試者，請于采尿前對外陰進行清洗。
（四）、胸水樣本采集
1、臨床收集胸水后若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；
2、將收集到的胸水1000 g離心10 min，收集上清液；
3、將得到的胸水上清3000 g離心10 min，收集上清，-80℃保存。
4、送樣量：30 mL
（五）、腹水樣本采集
1、臨床收集腹水后若不能第一時間處理，請于4℃臨時保存（不得超過8 h）；
2、將采集到的腹水在4℃下（室溫亦可）離心2000 g，20 min，去除腹水中的殘渣；-80℃保存；
3、送樣量：30 mL。
（六）、腦脊液樣本采集
1、采集方式為腰椎穿刺，樣本一經(jīng)分離，請務(wù)必立即置于冰上或4℃短暫保存（不得超過4 h），采樣時注意避免血液污染；
2、樣本室溫下2000 g離心20 min去除細胞及部分碎片，取上清，-80℃保存；
3、送樣量：5 mL。
注意事項：請勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放。
（七）、膽汁樣本采集
1、用無菌容器收集膽汁；
2、將收集到的膽汁在4℃下，3000 g離心10 min去除細胞沉渣和碎片；
3、收集膽汁上清液，4℃或者-20℃長期保存；
4、送樣量：5 mL。
（八）、細胞樣本采集
對于耐受無血清培養(yǎng)的細胞的處理流程：
1、細胞培養(yǎng)：對于貼壁細胞匯合密度在70%以上，用PBS洗滌細胞2-3遍去除殘留牛血清，添加無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；
2、上清收集：細胞上清先用200-300g離心10min，再用3000g離心10min，最后0.22um過膜或者10000g離心30min。將處理后的細胞上清經(jīng)100kd超濾管超濾濃縮（詳見參考文獻2.1）；
3、儲存運輸：將處理好的細胞上清收集在無菌培養(yǎng)瓶，-80保存或者干冰運輸，體積需求細胞上清原液大于200ml（對應(yīng)于10cm的大皿，至少需要20大皿）；
4、對于一些狀態(tài)良好的細胞上清，少至70ml，也可以得到較好的外泌體分離結(jié)果。
對于不耐受無血清培養(yǎng)的細胞的處理流程：
1、細胞培養(yǎng)：對于貼壁細胞匯合密度在70%以上，用PBS洗滌細胞2-3遍去除殘留牛血清，添加含5%無外泌體血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時；
2、上清收集：細胞上清先用200-300g離心10min，再用3000g離心10min，最后0.22um過膜或者10000g離心30min。將處理后的細胞上清經(jīng)100kd超濾管超濾濃縮（詳見參考文獻2.1）；
3、儲存運輸：將處理好的細胞上清收集在無菌培養(yǎng)瓶，-80保存或者干冰運輸，體積需求細胞上清原液大于200ml（對應(yīng)于10cm的大皿，至少需要20大皿）；
4、對于一些狀態(tài)良好的細胞上清，少至70ml，也可以得到較好的外泌體分離結(jié)果。
5、送樣量：細胞上清原液建議大于200 mL。
注：細胞上清樣本按照送樣體積收費，超濾濃縮步驟可選擇自己完成也可直接送公司完成。
參考文獻：Rong Xu, David W. Greening , Alin Rai, Hong Ji, Richard J. Simpson. Highly-purified exosomes and shed microvesicles isolated from the human colon cancer cell line LIM1863 by sequential centrifugal ultrafiltration are biochemically and functionally distinct. Methods. 2015 .1;87:11-25
【交付標準】
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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