RIP檢測(cè)
核酸和蛋白質(zhì)是組成生命的主要物質(zhì)，研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況，可以了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，幫助我們發(fā)現(xiàn)的miRNA的的的的的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，RIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用于蛋白與RNA互作關(guān)系的重要參考。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【應(yīng)用簡(jiǎn)介】
核酸和蛋白質(zhì)是組成生命的主要物質(zhì)，研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況，可以了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，幫助我們發(fā)現(xiàn)的miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，RIP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用于蛋白與RNA互作關(guān)系的重要參考。
【技術(shù)原理圖】
【實(shí)驗(yàn)方法】
第一步：細(xì)胞裂解液的制備
第二步：磁珠與抗體的準(zhǔn)備
第三步：RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀
第四步：用蛋白酶?對(duì)RNA-蛋白復(fù)合物進(jìn)行消化
第五步：RNA純化
第六步：對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA
第七步：Q-PCR驗(yàn)證RNA
案例展示
技術(shù)總結(jié)
【常見問(wèn)題】
1、經(jīng)過(guò)免疫沉淀后的RNA濃度過(guò)低；
2、Input組目的條帶無(wú)擴(kuò)增；
3、RNA純度未在1.8-2.1之間；
4、陰性對(duì)照IgG反應(yīng)中有目的條帶。
【注意事項(xiàng)】
1、RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體中均需保證無(wú)RNA酶；
2、細(xì)胞樣本的數(shù)量較大，應(yīng)按照所需要求提供細(xì)胞樣本數(shù)量；
3、選購(gòu)的相應(yīng)的抗體應(yīng)達(dá)到IP實(shí)驗(yàn)級(jí)別，并通過(guò)陰性實(shí)驗(yàn)反饋結(jié)果可信性。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過(guò)量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過(guò) 10μm，2~8 張，表面積不超過(guò) 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說(shuō)明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說(shuō)明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
微信關(guān)注公眾號(hào)
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