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實驗介紹
【應用簡介】
細胞凋亡是細胞主動實施的一種程序性死亡，是細胞的基本特征之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復、內環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著十分重要的作用。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。
【技術原理】
AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的PS高親和力特異性結合。因此Annexin V作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將AnnexinⅤ進行熒光素FITC標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙錠（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。
【實驗方法】
Step1：細胞培養(yǎng)
Step2：轉染或藥物處理
Step3：細胞收集
Step4：加凋亡試劑
Step5：上機檢測
案例展示
A) control組； B) 處理組low； C) 處理組middle； D) 處理組high
左下象限LL為活細胞；右下象限LR為早期凋亡細胞，右上象限UR為晚期凋亡；左上象限UL為碎片及死亡細胞。
常規(guī)凋亡率可計算UR+LR
技術總結
1、考慮到進行流式時需要用到對照組細胞設置空白組（用于調節(jié)電壓）和單染組細胞（用于調節(jié)補償），因此要求該組細胞量較其他組多；
2、如發(fā)現細胞密度偏低，細胞量較少，則適當增加離心時間。收集細胞時，應該連同上清一起收集，同時胰酶消化時間不宜過長，否則容易引起假陽性；
3、檢測細胞經過轉染等處理后可能會帶有自發(fā)熒光，應注意選擇凋亡試劑盒的顏色通道 如：帶綠色熒光時，應選擇7AAD試劑盒；
4、細胞鋪板應選擇細胞狀態(tài)良好的時候進行，且避免反復吹打；
5、流式樣品檢測需提前2-3個工作日預約。 流式檢測細胞樣本：細胞樣品準備時，使用不含EDTA的胰酶消化細胞，不得使用細胞刮刀進行操作，胰酶消化細胞時切忌消化過頭或沒有完全打開細胞間隙；
6、由于細胞活性問題，只接受活細胞樣本，當天完成實驗。
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 運輸條件 |
|---|---|---|
| 組織 | 離體后組織制成單細胞懸液，加入PBS培養(yǎng)基內 | 常溫運輸 |
| 活細胞 | 樣本量：1*106個細胞/TEST，加入PBS培養(yǎng)基內 | 常溫運輸 |
| 血液 | 將血液采集在EDTA肝素鈉的抗凝采血管內 | 常溫運輸 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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