酵母四雜交
酵母四雜交系統(tǒng)的原理是在酵母雙雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)上改進(jìn)的，用來驗(yàn)證RNA與RNA互作分析；從本質(zhì)上來說，在質(zhì)粒構(gòu)建過程中就是比酵母雙雜交系統(tǒng)多了一個基因表達(dá)框。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【技術(shù)原理】
酵母四雜交系統(tǒng)的原理是在酵母雙雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)上改進(jìn)的，用來驗(yàn)證RNA與RNA互作分析；從本質(zhì)上來說，在質(zhì)粒構(gòu)建過程中就是比酵母雙雜交系統(tǒng)多了一個基因表達(dá)框。
從原理和技術(shù)路線上是將兩個已知的RNA結(jié)合蛋白分別與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合domain(如LexA)和激活結(jié)構(gòu)域(activation domain)分別構(gòu)建融合蛋白。此外構(gòu)建兩個雜合RNA，各自含有二個不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中一個結(jié)合位點(diǎn)是與已知的RNA結(jié)合蛋白結(jié)合的頸環(huán)序列。當(dāng)RNA與RNA相互作用時可激活報道基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
1、RNA結(jié)合蛋白選用噬菌體MS2被殼蛋白(MS2 coat protein)，MS2 coat protein可識別RNA中的21nt的莖環(huán)序列，并與之有較高的親和力。
2、實(shí)驗(yàn)中需要用2個質(zhì)粒表達(dá)雜合RNA，一個含有MS2 coat protein結(jié)合位點(diǎn)、另一個含有RNA類型的轉(zhuǎn)錄激活標(biāo)簽m26。
【實(shí)驗(yàn)流程】
案例展示
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
微信關(guān)注公眾號
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