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實驗介紹
【技術原理】
首先標記 RNA（如生物素探針標記 RNA），將其與細胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白質復合物，分離復合物得到蛋白質，通過蛋白免疫印跡（western blot）或質譜（massspectrometry）檢測蛋白。
【實驗方法】
Step1：生物素探針標記RNA的制備
Step2：RNA抽提
Step3：細胞裂解
Step4：磁珠預處理
Step5：RNA與磁珠結合
Step6：RNA 與蛋白相互作用
Step7：蛋白的檢測
【實驗流程】
案例展示
Samples were normalized by volume. L = lysate load; FT = flow-through, E = eluate.
【結果分析】
根據(jù)Western blotting檢測結果可知帶標記的AR 3′-UTR RNA可以特異性的結合HuR蛋白。
技術總結
【常見問題】
1、RNA結合蛋白沒有結合
可能原因：（1）靶蛋白量不足；（2）緩沖體系不對；（3）RNA探針和蛋白的親和力本來就低。
解決方法：（1）增加上樣蛋白量；（2）應用低鹽體系；（3）加入交聯(lián)試劑。
2、RNA 降解
可能原因：無核酸酶的環(huán)境被破壞，比如RNA提取過程中的試劑及材料等；體外轉錄的RNA探針降解等。
解決方法：清洗和使用新開的離心管和試劑等；RNA探針合成后，電泳檢測其長度和濃度。
3、RNA結合蛋白的親和力不夠
可能原因：結合緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探針用量不足等。
解決方法：優(yōu)化孵育時間、溫度、鹽濃度等條件、增加裂解液和蛋白上樣量的比例、適當改變磁珠及探針用量、增加裂解液、確定生物素和鏈霉親和素效率等。
4、結合的非特異性高
可能原因：（1）緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化；（2）緩沖環(huán)境嚴謹性低；（3）樣品沒有裂解完全和裂解體系沒有優(yōu)化。
解決方法：（1）優(yōu)化孵育時間溫度鹽濃度等條件；（2）使用嚴謹性高的緩沖體系；（3）調低RNA探針和樣品的比例；（4）提高裂解液的量。
5. WB信噪比高
可能原因：（1）陽性信號率低；（2）一抗效率低；（3）蛋白沒有充分溶解。
解決方法：（1）增加二抗的量；（2）用敏感度的化學發(fā)光液；（3）用細胞裂解液預孵一抗；（4）增加樣品的量；（5）確定有沒有其他可能的結合情況；（6）增加裂解液用量。
【注意事項】
1、RIP反應體系中的試劑和抗體中均需保證無RNase；
2、磁珠與帶標簽的RNA要充分混合，可優(yōu)化孵育的溫度、時間以及RNA的含量等。
送檢與交付標準
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標記，且標記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標，樣本盡量新鮮，細胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細胞處理（加藥、轉染、感染）后狀態(tài)差應酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標準的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應實驗要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進行實驗，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應有能夠識別此抗體的標記，抗體的量應大于實驗所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進行預實驗，每個基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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