亞硫酸氫鹽測(cè)序法（BSP）
BSP又稱亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Bisulfite sequencing PCR），結(jié)合重亞硫酸鹽的測(cè)序法是一種靈敏的能直接檢測(cè)分析基因組DNA甲基化模式的方法。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【應(yīng)用簡介】
BSP又稱亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Bisulfite sequencing PCR），結(jié)合重亞硫酸鹽的測(cè)序法是一種靈敏的能直接檢測(cè)分析基因組DNA甲基化模式的方法。
【技術(shù)原理】
使用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶則不變。設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化序列的引物并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，將符合預(yù)期的產(chǎn)物純化回收連接T載體，進(jìn)行陽性克隆測(cè)序，即可了解每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況。通過統(tǒng)計(jì)分析，即可判斷某個(gè)特定基因特定CpG島區(qū)段內(nèi)的甲基化程度。
【實(shí)驗(yàn)流程】
1、引物設(shè)計(jì)與測(cè)試；
2、基因組提??；
3、亞硫酸氫鈉修飾DNA并純化回收修飾產(chǎn)物；
4、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收并連入T載；
5、測(cè)序分析；
6、甲基化分析與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。
案例展示
BSP克隆子的原始測(cè)序結(jié)果
圖1 測(cè)序結(jié)果比對(duì)示例
圖2 測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)點(diǎn)狀圖
注：每個(gè)圓圈代表一個(gè)CG位點(diǎn)，黑圈代表甲基化，白圈代表未甲基化；每一行代表一個(gè)樣本 TA 克隆的一個(gè)測(cè)序結(jié)果。
圖3 各樣本基因檢測(cè)區(qū)段組間的甲基化水平差異分析
常見問題
1、怎樣確定基因的目標(biāo)區(qū)域來進(jìn)行甲基化分析呢？
轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的CpG島進(jìn)行DNA甲基化分析的首選區(qū)域，一般位于啟動(dòng)子或者5‘UTR區(qū)。
2、 為什么文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的甲基化序列不在CpG島中？
CpG島是甲基化密集區(qū)域，但是沒有明顯的CpG島不代表就沒有甲基化，甲基化也可能發(fā)生在并不密集的CG區(qū)域。
3、BSP甲基化擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物可否直接測(cè)序，為什么需要構(gòu)建TA克隆后測(cè)序？
PCR產(chǎn)物是不同樣本的混合體，直接用PCR產(chǎn)物測(cè)序有可能在原有的C位點(diǎn)得到雙峰圖，以及由于測(cè)序前面一段序列不可靠而影響部分甲基化位點(diǎn)的判讀，無法準(zhǔn)確地確定甲基化的程度，因此建議進(jìn)行TA克隆后測(cè)序。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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