酵母單雜交技術(shù)
酵母單雜交技術(shù)是一種研究蛋白質(zhì)和特定DNA序列相互作用的技術(shù)方法，主要包括四個(gè)流程即：一、篩選含有報(bào)告基因的酵母單細(xì)胞株；二、構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)；三、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞；四、陽(yáng)性克隆菌株的篩選。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【技術(shù)原理】
酵母單雜交(yeast one hybrid)技術(shù)是體外分析DNA與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法，通過(guò)對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)狀況的分析，來(lái)鑒別DNA結(jié)合位點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因，或?qū)NA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析。
其基本原理為：真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由一個(gè)DNA特異性結(jié)合功能域和一個(gè)或多個(gè)其他調(diào)控蛋白相互作用的激活功能域組成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—bindingdomain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain，AD)?？蓸?gòu)建各種基因與AD的融合表達(dá)載體，在酵母中表達(dá)為融合蛋白時(shí)，根據(jù)報(bào)告基因的表達(dá)情況，便能篩選出與靶元件有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。理論上，在單雜交檢測(cè)中，任何靶元件都可被用于篩選一種與之有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。
運(yùn)用此技術(shù)，能篩選到與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，并可直接從基因文庫(kù)中得到編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而無(wú)需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作，故在蛋白研究中，具有一定的優(yōu)勢(shì)；而且，酵母屬真核細(xì)胞，通過(guò)酵母系統(tǒng)得到的結(jié)果比其他體外技術(shù)獲得的結(jié)果更能體現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況。
【實(shí)驗(yàn)流程】
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類(lèi)型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過(guò)量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線(xiàn)粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過(guò) 10μm，2~8 張，表面積不超過(guò) 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿(mǎn)足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說(shuō)明書(shū)要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說(shuō)明書(shū)。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話(huà)：400-691-6686
在線(xiàn)時(shí)間：8:00-24:00
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