co-IP免疫共沉淀/(Co-IP-WB/Co-IP-MS)
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【實(shí)驗(yàn)介紹】
Co-IP主要用于檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用，是IP實(shí)驗(yàn)的一種擴(kuò)展， 基于IP反應(yīng)的潛力，在樣品溶液中捕獲和純化主要目標(biāo)（抗原等）及通過(guò)天然相互作用靶標(biāo)結(jié)合的其他的大分子。此外，還可以利用Co-IP來(lái)確定在不同條件下的蛋白質(zhì)相互作用。
CO-IP的應(yīng)用場(chǎng)景主要是：
1、用于研究蛋白質(zhì)復(fù)合體成分（通過(guò)IP級(jí)抗體直接捕獲目的蛋白族群，或通過(guò)構(gòu)建帶標(biāo)簽的目的蛋白融合表達(dá)載體并通過(guò)標(biāo)簽蛋白的IP抗體進(jìn)行免疫捕獲。常與western blot和蛋白質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行IP產(chǎn)物分析）。
2、用于檢測(cè)生理狀態(tài)下存在的蛋白質(zhì)互作關(guān)系。
3、 用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的修飾狀態(tài)，如泛素化。
【技術(shù)原理】
免疫共沉淀是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌的Protein G或A能特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在細(xì)胞裂解液中加入感興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于磁珠的Protein G或A，若細(xì)胞中存在與興趣蛋白相結(jié)合的目的蛋白，就可以形成蛋白復(fù)合物：“目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—Protein G或A”；最后通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)目的蛋白。
【實(shí)驗(yàn)流程】
案例展示
技術(shù)總結(jié)
【技術(shù)總結(jié)】
1、實(shí)驗(yàn)樣品制備方法準(zhǔn)備：很重要！根據(jù)研究目的，檢測(cè)樣品可能是組織樣品，也可能是細(xì)胞樣品，不同樣品制備流程不太相同，目的蛋白表達(dá)量也有較大差別，必須選擇合適的樣品和樣品制備方法。
2、根據(jù)研究目的選擇適合的蛋白特異性抗體：非常重要！用于Co-IP實(shí)驗(yàn)的抗體是針對(duì)目的蛋白的特異性抗體，最理想的是選擇一種能識(shí)別興趣蛋白質(zhì)某個(gè)表位的抗體，且這個(gè)表位不會(huì)被任何其他蛋白質(zhì)相互作用所掩蓋，比普通WB抗體要求高出很多；同時(shí)，抗體特異性和靈敏性盡可能高，才有可能有干凈的背景和較好的IP效果，所以必須選擇最適合的抗體用于Co-IP實(shí)驗(yàn)。
【注意事項(xiàng)】
1、細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP-40 或 Triton- X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定；
2、不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑；
3、使用對(duì)照抗體：?jiǎn)慰寺】贵w：正常小鼠的 IgG 或另一類單抗;兔多克隆抗體：正常兔 IgG；
4、確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；
5、要確保抗體的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會(huì)引起共沉淀；
6、確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過(guò)量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識(shí) |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測(cè)）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過(guò) 10μm，2~8 張，表面積不超過(guò) 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說(shuō)明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說(shuō)明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識(shí)別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對(duì)引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
微信關(guān)注公眾號(hào)
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